梓葛凍干粉針對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞缺氧-復(fù)氧損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制研究.pdf

1、背景：梓葛凍干粉針為本團(tuán)隊(duì)自主研發(fā)的中藥單體復(fù)方注射劑，其主要藥效成分為梓醇和葛根素，擬用于缺血性卒中的治療。本團(tuán)隊(duì)在前期的體內(nèi)、外試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)梓葛凍干粉針對(duì)缺血性卒中損傷模型具有保護(hù)作用，但其分子機(jī)制尚不清楚。本課題觀察了梓葛凍干粉針對(duì)體外星形膠質(zhì)細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷模型的保護(hù)作用，并闡明了其分子作用機(jī)制。本課題獲得了國(guó)家自然科學(xué)基金（面上項(xiàng)目81473549，青年項(xiàng)目31402237）、教育部博士學(xué)科點(diǎn)專項(xiàng)基金（博導(dǎo)類：20110182

2、110012）、重慶市衛(wèi)生局中醫(yī)藥科研重大項(xiàng)目（渝中醫(yī)2010[60]2010-1-4）、重慶市基礎(chǔ)與前沿研究計(jì)劃項(xiàng)目（cstc2014jcyjA80023）、教育部中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)（XDJK2014C058）的支持。
　　目的：觀察梓葛凍干粉針對(duì)原代培養(yǎng)的SD大鼠大腦皮層星形膠質(zhì)細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷的保護(hù)作用，并闡明其發(fā)揮的保護(hù)作用的機(jī)制。為梓葛凍干粉針的新藥創(chuàng)制提供基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法：
　　1.SD大鼠大

3、腦皮層星形膠質(zhì)細(xì)胞的原代分離培養(yǎng)與鑒定無菌分離新生2-3d的SD大鼠乳鼠大腦皮層，經(jīng)消化過濾后，于含10％FBS的DMEM-F12培養(yǎng)基中進(jìn)行星形膠質(zhì)細(xì)胞的培養(yǎng)。待細(xì)胞長(zhǎng)至融合時(shí)，以220rpm的速度于搖床上旋轉(zhuǎn)振蕩18h對(duì)細(xì)胞進(jìn)行純化。利用FITC-GFAP并結(jié)合DAPI對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光鑒定，細(xì)胞純度用Image-Pro Plus6.0進(jìn)行分析。
　　2.星形膠質(zhì)細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷模型的建立及梓葛凍干粉針的保護(hù)作用試驗(yàn)

4、分為正常組、模型組、輔料組（β-環(huán)糊精）以及梓葛凍干粉針12.25μg·mL-1組、24.50μg·mL-1組和49.00μg·mL-1組。每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔。星形膠質(zhì)細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷模型的建立參照實(shí)驗(yàn)室前期實(shí)驗(yàn)方法，選擇缺氧6h，復(fù)氧12h作為損傷條件。輔料組和藥物組分別在缺氧和復(fù)氧開始時(shí)給藥一次。利用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞損傷前后的形態(tài)變化；同時(shí)，在復(fù)氧結(jié)束時(shí)后，采用MTT法測(cè)定各組細(xì)胞的存活率，測(cè)定LDH漏出率以評(píng)價(jià)細(xì)胞膜的損傷程度；采

5、用TUNEL熒光染色法細(xì)胞凋亡率；并利用Western blot法檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白Caspase-9、Caspase-3和PRAP-1等蛋白在細(xì)胞中的表達(dá)水平。
　　3.梓葛凍干粉針對(duì)缺氧/復(fù)氧損傷星形膠質(zhì)細(xì)胞炎癥反應(yīng)的抑制作用及其機(jī)制研究復(fù)氧結(jié)束后，采用硝酸還原酶法測(cè)定各組細(xì)胞培養(yǎng)液中NO的釋放量；ELISA法檢測(cè)TNF-α、IL-1β及PGE2在細(xì)胞培養(yǎng)液中的釋放量；Western blot法檢測(cè)細(xì)胞中iNOS、COX-2、N

6、F-κB p65，p-NF-κB p65，IκB-α，p-IκB-α及p-IKKα/β等蛋白的表達(dá)量。
　　4.梓葛凍干粉針對(duì)缺氧/復(fù)氧損傷星形膠質(zhì)細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)的抑制作用及其機(jī)制研究復(fù)氧結(jié)束后，分別采用黃嘌呤氧化酶法、硫代巴比妥酸顯色法及二硫代二硝基苯甲酸顯色法檢測(cè)各組細(xì)胞中SOD、MDA和GSH的含量；熒光酶標(biāo)儀檢測(cè)細(xì)胞中DCFH-DA探針的熒光強(qiáng)度，以反映細(xì)胞中ROS的生成量；并利用Western bolt法檢測(cè)Nrf-2

7、和HO-1蛋白在細(xì)胞中的表達(dá)水平。
　　結(jié)果：
　　1.成功分離培養(yǎng)出原代SD大鼠大腦皮層星形膠質(zhì)細(xì)胞星形膠質(zhì)細(xì)胞在接種24h內(nèi)完成貼壁，2d后細(xì)胞逐漸增殖，并在第3-4d增殖速度最快，第5d時(shí)細(xì)胞數(shù)量進(jìn)一步增加，到第6d時(shí)細(xì)胞已基本鋪滿整個(gè)培養(yǎng)瓶底部。細(xì)胞搖瓶純化后，經(jīng)GFAP-FITC結(jié)合DAPI免疫熒光鑒定為星形膠質(zhì)細(xì)胞，其純度達(dá)97%以上。
　　2.梓葛凍干粉針對(duì)缺氧/復(fù)氧損傷星形膠質(zhì)細(xì)胞具有保護(hù)作用與正常組相

8、比，模型組細(xì)胞存活率顯著降低，LDH漏出率顯著增高（均P<0.01），細(xì)胞胞體劇烈收縮，部分細(xì)胞脫落，數(shù)量降低，光澤度降低；同時(shí)，模型組細(xì)胞凋亡率及Caspase-9和Caspase-3蛋白表達(dá)水平均顯著升高，PARP-1含量顯著降低（均P<0.01）。與模型組相比，梓葛凍干粉針12.25μg·mL-1組、24.50μg·mL-1組和49.00μg·mL-1組細(xì)胞存活率均顯著升高（均P<0.05），LDH漏出率均顯著降低（均P<0.05

9、），細(xì)胞的形態(tài)有所著改善，細(xì)胞胞體較舒展，密度增加，光澤度有所恢復(fù)；同時(shí)，細(xì)胞凋亡率及 Caspase-9和Caspase-3蛋白表達(dá)量均顯著降低，PARP-1含量顯著升高（均P<0.05）。
　　3.梓葛凍干粉針可有效抑制缺氧/復(fù)氧損傷星形膠質(zhì)細(xì)胞中炎.癥反應(yīng)的發(fā)生與正常組相比，模型組細(xì)胞培養(yǎng)液中TNF-α、IL-1β、NO和PGE2的釋放量及細(xì)胞iNOS和COX-2蛋白表達(dá)量均顯著升高（均P<0.01）。與模型組相比，梓葛凍干

10、粉針12.25μg·mL-1組、24.5μg·mL-1組和49.00μg·mL-1組細(xì)胞培養(yǎng)液中IL-1β、NO和PGE2釋放量以及細(xì)胞iNOS蛋白表達(dá)水平均顯著降低（均P<0.05）；并且梓葛凍干粉針24.50μg·mL-1組和49.00μg·mL-1組細(xì)胞培養(yǎng)液中TNF-α釋放量和細(xì)胞中COX-2蛋白的表達(dá)水平也顯著降低（均P<0.05）。
　　與正常組相比，模型組細(xì)胞IKKα/β、IκB-α和NF-κB p65等蛋白的磷酸化

11、水平均顯著升高（均P<0.01）。與模型組相比，梓葛凍干粉針12.25μg·mL-1組、24.50μg·mL-1和49.00μg·mL-1組細(xì)胞中NF-κB p65蛋白的磷酸化水平均顯著降低（均P<0.05）。并且梓葛凍干粉針24.50μg·mL-1和49.00μg·mL-1組細(xì)胞中 IKKα/β和IκB-α蛋白的磷酸化水平也顯著降低（均P<0.05）。
　　4.梓葛凍干粉針可顯著抑制缺氧/復(fù)氧引起的星形膠質(zhì)細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷與正常

12、組相比，模型組細(xì)胞中ROS和MDA含量顯著升高，同時(shí)SOD活性和GSH含量均顯著降低（均 P<0.01）。與模型組相比，梓葛凍干粉針12.25μg·mL-1組、24.50μg·mL-1組和49.00μg·mL-1組細(xì)胞中MDA和ROS含量顯著降低，GSH含量顯著升高（均P<0.05）；并且梓葛凍干粉針24.50μg·mL-1組和49.00μg·mL-1組細(xì)胞中SOD活性也顯著升高（均P<0.05）。
　　與正常組相比，模型組細(xì)胞中

13、Nrf-2和HO-1蛋白的表達(dá)水平均出現(xiàn)顯著升高（均P<0.05）。與模型組相比，梓葛凍干粉針12.25μg·mL-1組、24.50μg·mL-1組和49.00μg·mL-1組細(xì)胞中Nrf-2和HO-1蛋白的表達(dá)水平均出現(xiàn)進(jìn)一步升高，并具有顯著性差異（均P<0.05）。
　　結(jié)論：
　　1.成功分離培養(yǎng)出原代的SD大鼠大腦皮層星形膠質(zhì)細(xì)胞，其純度達(dá)97%以上，符合試驗(yàn)要求。
　　2.梓葛凍干粉針對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞的缺氧/復(fù)

14、氧損傷具有保護(hù)作用，能夠顯著改善細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特征，提高損傷細(xì)胞的存活率，降低LDH漏出率，并抑制細(xì)胞凋亡。
　　3.梓葛凍干粉針可有效抑制缺氧/復(fù)氧損傷星形膠質(zhì)細(xì)胞炎癥反應(yīng)的發(fā)生，能夠抑制NF-κB信號(hào)通路的激活，顯著降低細(xì)胞中炎癥因子的釋放量。
　　4.梓葛凍干粉針可顯著抑制缺氧/復(fù)氧引起的星形膠質(zhì)細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷，能夠有效抑制氧自由基的產(chǎn)生并促進(jìn)抗氧化蛋白的生成，其機(jī)制可能與藥物能進(jìn)一步激活Nrf-2/HO-1信號(hào)通路有