梓葛凍干粉針對大鼠急性腦缺血損傷半暗帶神經(jīng)血管單元的整體保護(hù)作用.pdf

1、1.研究背景
　　抑制或減輕中風(fēng)急性期半暗帶細(xì)胞凋亡或死亡，避免梗死灶擴(kuò)大，是公認(rèn)的較為理想的缺血性中風(fēng)腦保護(hù)策略。課題組自主研制的抗中風(fēng)藥物—梓葛凍干粉針(由地黃藥效成分梓醇和葛根藥效成分葛根素組成），在永久缺血性腦中風(fēng)模型大鼠和小鼠的非急性期，以及缺血再灌注損傷的腦中風(fēng)模型大鼠中，均表現(xiàn)出較好的腦保護(hù)作用。然而，梓葛凍干粉針對永久缺血性腦中風(fēng)模型大鼠急性期的腦保護(hù)作用尚未觀察，其對腦缺血半暗帶中神經(jīng)血管單元細(xì)胞的整體保護(hù)作用及

2、其可能的通路機(jī)制有待研究。本研究獲得了國家自然科學(xué)基金面上項目（81473549）、教育部博士學(xué)科點專項基金項目（博導(dǎo)類：20110182110012）、教育部中央高校基本科研業(yè)務(wù)費項目（XDJK2014D023）以及重慶市衛(wèi)生局中醫(yī)藥科研重大項目（渝中醫(yī)2010[60]2010-1-4）的支持。
　　2.研究目的
　　研究梓葛凍干粉針對永久缺血性腦中風(fēng)模型大鼠急性期的腦保護(hù)作用，以及對腦缺血半暗帶中神經(jīng)血管單元的整體保護(hù)作

3、用和機(jī)制，為將梓葛凍干粉針開發(fā)成治療缺血性腦中風(fēng)的候選藥物提供基礎(chǔ)研究數(shù)據(jù)。
　　3.方法與結(jié)果
　　3.1梓葛凍干粉針對大鼠急性腦缺血損傷整體保護(hù)作用研究
　　方法用線栓法梗塞大腦中動脈，復(fù)制大鼠中風(fēng)模型。在造模大鼠蘇醒2h后，采用改良神經(jīng)功能缺損評分法（mNSS）進(jìn)行評分并分組。以mNSS評分得4分及以上且各項均有缺損為標(biāo)準(zhǔn)，判定造模成功。將造模成功的64只大鼠隨機(jī)分為4個組，每組16只：模型組，梓葛凍干粉針65.

4、4 mg·kg-1、32.7 mg·kg-1和16.4 mg·kg-1組。另設(shè)假手術(shù)組16只。尾靜脈注射梓葛凍干粉針或生理鹽水，一天2次，給藥1天。
　　造模24 h后：
　　①用mNSS評分法再次評價大鼠的神經(jīng)功能，并分析組間差異顯著性。
　?、诿拷M取8只大鼠麻醉處死，分離新鮮大腦用腦模切片，作TTC染色，拍照后，用軟件測算腦梗死面積百分比，并分析比較組間差異顯著性。
　?、勖拷M另取8只大鼠麻醉，灌流固定后分離

5、大腦，冰凍切片后作HE染色，用顯微鏡觀察并拍照，比較組間腦缺血半暗帶組織的損傷情況。
　　結(jié)果與假手術(shù)組相比，模型組大鼠mNSS得分和腦梗死面積百分比均顯著增加（p<0.01），缺血區(qū)腦組織大面積壞死，部分區(qū)皮質(zhì)域呈高度疏松篩網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，細(xì)胞結(jié)構(gòu)不清，紅色壞死神經(jīng)元顯著增加。與模型組相比，梓葛凍干粉針65.4 mg·kg-1、32.7 mg·kg-1和16.4 mg·kg-1組大鼠mNSS得分和腦梗死面積百分比均顯著下降(p<0.0

6、1、p<0.05)，缺血區(qū)腦組織壞死程度顯著減輕，紅色壞死神經(jīng)元顯著減少。
　　3.2梓葛凍干粉針抗大鼠急性腦缺血損傷半暗帶保護(hù)機(jī)制研究
　　方法造模及分組給藥方法同第一章，每組12只大鼠。造模24 h后：
　?、倜拷M取6只大鼠，按第一章方法制作大腦冰凍切片，用TUNEL+特異性蛋白雙重免疫熒光染色標(biāo)記腦片，熒光顯微鏡觀察缺血半暗帶大腦皮質(zhì)區(qū)神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞和微血管內(nèi)皮細(xì)胞生長形態(tài)并拍照，用軟件分析3種細(xì)胞的凋亡率

7、，并比較組間差異顯著性。
　?、诹砣∧X片，用免疫組化技術(shù)分別標(biāo)記Bax、Bcl-2、Caspase-3、Cleaved caspase-3和Cyt-C蛋白，用顯微鏡觀察缺血半暗帶大腦皮質(zhì)區(qū)并拍照。
　　③每組另取6只大鼠麻醉取腦，提取缺血半暗帶大腦皮質(zhì)組織勻漿蛋白，用WB檢測勻漿蛋白中Bax、Bcl-2、Caspase-3、Cleaved caspase-3和Cyt-C蛋白表達(dá)，并分析比較組間差異顯著性。
　　結(jié)果與假

8、手術(shù)組相比，模型組大鼠缺血半暗帶大腦皮質(zhì)層區(qū)域神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞和微血管內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡率顯著增加(p<0.01)，細(xì)胞生長形態(tài)嚴(yán)重受損，促細(xì)胞凋亡的Bax、Caspase-3、Cleaved caspase-3和Cyt-C蛋白表達(dá)均顯著增加(p<0.01)，抑制細(xì)胞凋亡的Bcl-2蛋白表達(dá)顯著減少(p<0.01)。與模型組相比，梓葛凍干粉針65.4 mg·kg-1、32.7 mg·kg-1和16.4 mg·kg-1組大鼠缺血半暗帶大腦

9、皮質(zhì)區(qū)域該3種細(xì)胞的凋亡率均顯著降低(p<0.01)，其生長形態(tài)明顯改善，上述促調(diào)蛋白表達(dá)均顯著減少(p<0.01，p<0.05)；其中，梓葛凍干粉針65.4 mg·kg-1組大鼠Bcl-2蛋白表達(dá)顯著增加(p<0.01)。
　　3.3體外腦神經(jīng)血管單元半暗帶損傷模型的建立及梓葛凍干粉針的整體保護(hù)作用研究
　　方法:
　　①大鼠大腦皮層神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞和微血管內(nèi)皮細(xì)胞的原代培養(yǎng)，以及由該3種細(xì)胞共培養(yǎng)組成的腦神經(jīng)血

10、管單元模型的構(gòu)建，均參照課題組前期方法。
　　②用文獻(xiàn)報道的半暗帶條件培養(yǎng)液，對所建立的腦神經(jīng)血管單元模型進(jìn)行損傷，24 h后，以細(xì)胞生長狀態(tài)、數(shù)量、軸突長度和細(xì)胞跨內(nèi)皮電阻值顯著（p＜0.05）低于正常培養(yǎng)孔為標(biāo)準(zhǔn)，判定體外腦神經(jīng)血管單元半暗帶損傷模型構(gòu)建成功。
　　③將構(gòu)建的腦神經(jīng)血管單元模型隨機(jī)分為5個組，每組6個孔：正常培養(yǎng)組、損傷模型組（半暗帶條件培養(yǎng)液損傷24 h）、梓葛凍干粉針3個劑量組（于更換半暗帶條件培養(yǎng)液

11、時加入49.0μg·mL-1、24.5μg·mL-1以及12.25μg·mL-1的梓葛凍干粉針）。用藥24 h后，用顯微鏡觀察3種細(xì)胞的生長形態(tài)并拍照，用臺盼藍(lán)計數(shù)法檢測星形膠質(zhì)細(xì)胞和微血管內(nèi)皮細(xì)胞的活細(xì)胞數(shù)量，用圖像分析軟件測量神經(jīng)元軸突長度，用細(xì)胞電阻儀檢測模型中跨內(nèi)皮電阻值，并分析比較組間差異顯著性。
　　結(jié)果:
　　①成功分離培養(yǎng)出高純度的大鼠大腦皮層3種原代細(xì)胞，構(gòu)建了由該3種細(xì)胞共培養(yǎng)的腦神經(jīng)血管單元整體模型。與

12、單細(xì)胞培養(yǎng)相比，共培養(yǎng)模型中神經(jīng)元胞體圓潤且立體感強(qiáng)，軸突更粗大且長并形成致密網(wǎng)絡(luò)；腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞胞間接觸更緊密，形成致密的單層；腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞活細(xì)胞數(shù)量、神經(jīng)元軸突長度以及模型跨內(nèi)皮電阻值均顯著增加（p<0.05。p<0.01）。
　　②與正常培養(yǎng)組相比，經(jīng)半暗帶條件培養(yǎng)液損傷的腦神經(jīng)血管單元整體模型組中，神經(jīng)元立體感較差，胞體和軸突變小，軸突網(wǎng)絡(luò)密度降低；腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞胞體收縮，

13、部分細(xì)胞出現(xiàn)脫落；腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞活細(xì)胞數(shù)量、神經(jīng)元軸突長度以及跨內(nèi)皮電阻值均顯著降低（p<0.01）。與半暗帶條件培養(yǎng)液損傷的腦神經(jīng)血管單元整體模型組相比，梓葛凍干粉針49.0μg·mL-1、24.5μg·mL-1以及12.25μg·mL-1組腦神經(jīng)血管單元整體模型中，神經(jīng)元胞體無明顯收縮，突觸網(wǎng)絡(luò)仍較緊密；微血管內(nèi)皮細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞胞體輕微收縮，胞間接觸仍較緊密；腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞活細(xì)胞數(shù)量、腦神經(jīng)血管單

14、元整體跨內(nèi)皮電阻值均顯著增加（p<0.01）；其中，梓葛凍干粉針49.0μg·mL-1和24.5μg·mL-1組神經(jīng)元軸突長度顯著增加（p<0.01）。
　　3.4梓葛凍干粉針抗體外腦神經(jīng)血管單元模型半暗帶損傷的機(jī)制研究
　　方法①大鼠大腦皮層3種原代細(xì)胞的培養(yǎng)、腦神經(jīng)血管單元模型的構(gòu)建及體外腦神經(jīng)血管單元模型半暗帶損傷方法同第3章。②將構(gòu)建的腦神經(jīng)血管單元模型隨機(jī)分為7個組，每組6孔：正常培養(yǎng)組：在正常培養(yǎng)條件下培養(yǎng)；損傷

15、模型組：半暗帶條件培養(yǎng)液損傷24 h；梓葛凍干粉針3個劑量組：在更換半暗帶條件培養(yǎng)液時添加梓葛凍干粉針，使其終濃度分別為49.0μg·mL-1、24.5μg·mL-1、12.25μg·mmL-1；抑制劑MG132組：在更換半暗帶條件培養(yǎng)液時添加MG132，使其終濃度為10μM；49.0μg·mmL-1梓葛凍干粉針+MG132組：在更換半暗帶條件培養(yǎng)液時，添加梓葛凍干粉針（49.0μg·mL-1）和MG132（10μM）。③用藥后，用流式

16、細(xì)胞儀檢測不同組別腦神經(jīng)血管單元細(xì)胞共培養(yǎng)模型中3種細(xì)胞凋亡率，并分析比較組間差異顯著性。④用試劑盒提取不同組別腦神經(jīng)血管單元模型細(xì)胞總蛋白，蛋白定量后，按WB操作步驟，檢測分析Bax、Bcl-2、Caspase3、Cleaved caspase-3、Caspase-9、Cleaved caspase-9、Cyt-C、XIAP的蛋白表達(dá)，并分析比較組間差異顯著性。
　　結(jié)果與正常培養(yǎng)組相比，經(jīng)半暗帶條件培養(yǎng)液損傷的腦神經(jīng)血管單元模

17、型組中，神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞和微血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡率均顯著增加（p<0.01），細(xì)胞Bax、Cyt-C、 Cleaved caspase-9、Caspase-3和Cleaved caspase-3蛋白表達(dá)均顯著增加（p<0.01），Bcl-2和XIAP蛋白表達(dá)顯著降低（p<0.01）。與半暗帶條件培養(yǎng)液損傷的腦神經(jīng)血管單元整體模型組相比，梓葛凍干粉針49.0μg.mL-1及24.50μg.mL-1組該3種細(xì)胞的凋亡率均顯著降低（p<0.0

18、1），Cyt-C、Cleaved caspase-9和Cleaved caspase-3的蛋白表達(dá)均顯著降低（p<0.01），Bcl-2和XIAP的蛋白表達(dá)均顯著升高（p<0.01），其中梓葛凍干粉針49.0μg·mL-1組Bax蛋白表達(dá)顯著降低（p<0.01）。與梓葛凍干粉針49.0μg·mL-1組相比，MG132+梓葛凍干粉針49.0μg·mL-1組XIAP蛋白與Cleaved caspase-3蛋白表達(dá)均顯著增加（p<0.01，p

19、<0.05）。
　　4.研究結(jié)論
　　4.1梓葛凍干粉針能減輕大鼠腦缺血區(qū)域受損細(xì)胞形態(tài)變化，減少細(xì)胞死亡，減少缺血區(qū)腦組織梗死灶面積，改善大鼠神經(jīng)功能，對大鼠急性腦缺血損傷發(fā)揮整體保護(hù)作用。
　　4.2梓葛凍干粉針對大鼠急性腦缺血損傷的整體保護(hù)作用，主要是通過抑制缺血半暗帶區(qū)神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞和微血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡實現(xiàn)的，其機(jī)制與調(diào)節(jié)線粒體凋亡通路有關(guān)。
　　4.3梓葛凍干粉針對急性腦缺血半暗帶神經(jīng)血管單元細(xì)胞