梓葛凍干粉針對大鼠腦微循環(huán)障礙的改善作用及其機制研究.pdf

1、背景：
　　“梓葛凍干粉針”為本實驗室自主創(chuàng)制的抗腦缺血卒中的中藥單體復(fù)方新藥，由梓醇和葛根素組成，已經(jīng)申請技術(shù)發(fā)明專利。課題組前期已經(jīng)進行了該制劑對大鼠永久性腦缺血后神經(jīng)功能恢復(fù)，對腦梗死面積、腦血管新生和改善氣虛血瘀證等方面的研究。但該制劑對腦部微循環(huán)是否有影響，尚不確定，有待研究。
　　目的：
　　在整體動物與離體細胞實驗中，觀察梓葛凍干粉針對腦缺血再灌注損傷的保護作用效果，并從調(diào)節(jié)微血管的舒縮功能、通透性和血液

2、流變性的角度，探討其對腦微循環(huán)保護作用的機制。
　　方法：
　　1.梓葛凍干粉針對大鼠局灶性腦缺血/再灌注損傷腦微循環(huán)障礙的改善作用取雄性SD大鼠80只，采用隨機數(shù)字法分為假手術(shù)組（10只）、缺血1h再灌注組（20只，造模成功16只）、缺血2h再灌注組（20只，造模成功14只）、缺血4h再灌注組（20只，造模成功8只）和尼莫地平組（缺血2h后再灌注，2.00 mg·kg-1，10只，造模成功8只），大鼠再灌注時即刻給藥(再灌

3、注0h)，尾靜脈注射給藥，每天1次（10 mL·kg-1，體質(zhì)量），連續(xù)給藥14d，假手術(shù)組和模型組給同等體積的生理鹽水。采用大鼠大腦左側(cè)中動脈線栓法(MCAO)復(fù)制腦缺血/再灌注（I/R）模型，進行神經(jīng)行為學(xué)評定，分別在缺血1h、2h和4h后再灌注，并于造模后1d、4d、7d、14d對大鼠進行改良神經(jīng)功能缺損評分(mNSS)。
　　取雄性SD大鼠540只，線栓法復(fù)制I/R模型，隨機分為假手術(shù)組（60只）、模型組（80只，造模成功

4、61只）、葛根素注射液組（30.00 mg·kg-1，80只，造模成功68只）、尼莫地平組（2.00 mg·kg-1，80只，造模成功69只）、梓葛凍干粉針16.40 mg·kg-1（80只，造模成功65只）、32.70 mg·kg-1（80只，造模成功68只）和65.40 mg·kg-1組（80只，造模成功70只），大鼠再灌注時即刻給藥（再灌注0h），尾靜脈注射給藥，每天1次（10 mL·kg-1，體質(zhì)量），考察時間點分為缺血2h再灌

5、注1d、4d、7d和14d，假手術(shù)組和模型組給同等體積的生理鹽水。大鼠進行神經(jīng)功能缺損評分，應(yīng)用激光多普勒血流量儀測定軟腦膜血流量的變化;HE染色光鏡下觀察大鼠皮層區(qū)病理形態(tài)學(xué)變化和損傷狀況;TTC染色測定梗死體積;干濕法測定腦組織含水量;伊文氏藍(EB)含量測血管的通透性;免疫組化染色法檢測CD31表達。
　　取雄性SD大鼠960只，隨機分為假手術(shù)組（96只）、模型組（144只，造模成功109只）、葛根素注射液組（30.00 m

6、g·kg-1，144只，造模成功120只）、尼莫地平組（2.00 mg·kg-1，144只，造模成功123只）、梓葛凍干粉針16.40 mg·kg-1（144只，造模成功117只）、32.70 mg·kg-1（144只，造模成功122只）和65.40mg·kg-1（144只，造模成功126只）組，大鼠再灌注時即刻給藥(再灌注0 h)，尾靜脈注射給藥，每天1次（10 mL·kg-1，體質(zhì)量），考察時間點分為缺血2h再灌注1d、4d、7d和

7、14d，假手術(shù)組和模型組給同等體積的生理鹽水。酶免疫試劑盒檢測患側(cè)腦皮層微血管中一氧化氮合成酶(NOS)、內(nèi)皮素(ET-1)、6-酮-前列腺素F1α(6-Ke-to-PGF1α)和血栓素B2(TXB2)的含量;應(yīng)用熒光定量PCR(qPCR)和免疫印跡(Westemblot)檢測腦皮層微血管的MMP-9、ZO-1、Occludin及Claudin-5 mRNA和蛋白的表達變化。
　　2.梓葛凍干粉針對高分子葡聚糖大鼠腦微循環(huán)障礙的改

8、善作用
　　取雄性SD大鼠120只，隨機分為正常對照組、模型組、尼莫地平(2.00mg·kg-1)、梓葛凍干粉針16.40 mg·kg-1、32.70 mg·kg-1和65.40 mg·kg-1組，每組20只，尾靜脈注射給藥，每天1次（10 mL·kg-1，體質(zhì)量），連續(xù)給藥14d后開顱窗，并于末次給藥30 min后，大鼠（除正常對照組）再經(jīng)股靜脈給予10％高分子葡聚糖T-500(10 mL·kg-1)復(fù)制大鼠急性腦微循環(huán)障礙模型

9、，生物顯微鏡下觀察大鼠造模前5 min和造模后1、5、10、20、40、60 min時間點軟腦膜微動靜脈直徑，激光多普勒血流儀監(jiān)測血流量，電阻法測紅細胞壓積，全自動血液流變儀測流變學(xué)指標。
　　3.梓葛凍千粉針對體外缺氧/復(fù)氧損傷大鼠腦微血管內(nèi)皮細胞mmp-9蛋白表達的影響
　　采用氧糖剝奪的方法，建立體外培養(yǎng)大鼠腦微血管內(nèi)皮細胞的缺氧復(fù)氧模型（模擬體內(nèi)腦缺血再灌注損傷模型）。MTT法檢測內(nèi)皮細胞的增殖。內(nèi)皮細胞缺糖缺氧2h

10、再復(fù)氧24 h損傷后，Western blot檢測mmp-9蛋白表達。
　　結(jié)果：
　　1.梓葛凍干粉針對大鼠局灶性腦缺血/再灌注的腦微循環(huán)障礙的改善作用
　　(1)大鼠局灶性腦缺血/再灌注模型復(fù)制及神經(jīng)行為學(xué)評定
　　腦缺血/再灌注損傷后大鼠神經(jīng)功能缺損明顯，其中損傷后1 d mNSS評分1h、2h、4h組分別為5.68±0.75、9.23±1.05、11.53±1.88;14d梗死面積比率分別為0.1026±

11、0.0214、0.2245±0.0228、0.3828±0.0318。缺血1h組主要的梗死部位為皮質(zhì)，2h、4h組主要梗死部位為皮質(zhì)及基底節(jié)區(qū)。確定缺血2h為最佳的造模時間進行后續(xù)實驗。
　　(2)梓葛凍干粉針對腦缺血/再灌注大鼠腦微循環(huán)血流量、梗死體積及腦水腫的影響
　　梓葛凍干粉針（16.40 mg·kg-1、32.70 mg·kg-1和65.40 mg·kg-1）可在再灌注時使腦血流緩慢恢復(fù)。TTC染色結(jié)果顯示，假手術(shù)

12、組腦組織均呈深紅色未見梗死灶;模型組可見大面積的梗死灶，多位于左側(cè)皮質(zhì)和基底節(jié)區(qū);再灌注14d，與模型組相比，梓葛凍干粉針65.40 mg·kg-1組梗死體積顯著減少(P＜0.05)，提示梓葛凍干粉針可減輕大鼠腦缺血/再灌注的損傷。
　　與假手術(shù)組相比，模型組大鼠腦組織含水量和EB含量顯著升高(P＜0.01)，顯示造模成功。再灌注7d和14d，與模型組相比，梓葛凍干粉針(16.40 mg·kg-1、32.70 mg·kg-1和65

13、.40 mg·kg-1)可明顯抑制大鼠的病變側(cè)腦組織含水量和EB含量升高(P＜0.05，P＜0.01)，提示其可改善腦缺血/再灌注損傷大鼠的血管通透性。
　　HE染色觀察，腦缺血再灌注后大鼠大腦缺血側(cè)細胞層次紊亂，細胞壞死，胞核萎縮成不規(guī)則狀，水腫，疏松，炎性細胞浸潤。而梓葛凍干粉針(16.40 mg·kg-1、32.70 mg·kg-1和65.40 mg·kg-1)組在相應(yīng)考察時間點可減少炎性細胞浸潤，減小細胞周圍間隙和水腫。<

14、br>　　(3)梓葛凍干粉針對局灶性腦缺血/再灌注大鼠腦微血管密度的影響
　　免疫組化結(jié)果顯示，假手術(shù)組CD31陽性細胞表達很少。與假手術(shù)組相比，模型組再灌注后1d缺血側(cè)大鼠皮層區(qū)有少量CD31陽性細胞表達，到4d、7d有較高表達，7d以后陽性細胞表達增多緩慢或基本不增長(P＜0.01)。與模型組陽性細胞表達相比，葛根素注射液組(30.00 mg·kg-1)、尼莫地平組(2.00 mg·kg-1)、梓葛凍干粉針16.40 mg·k

15、g-1、32.70 mg·kg-1和65.40 mg·kg-1組的梗死灶周邊區(qū)陽性細胞表達，除再灌注后1d的無顯著差異外，其余各個時間點的陽性細胞表達均顯著增多(P＜0.01)，提示其可能促進了腦缺血/再灌注損傷大鼠血管新生。
　　(4)梓葛凍干粉針對腦缺血/再灌注大鼠的腦微循環(huán)中微血管舒縮功能的影響
　　與假手術(shù)組相比，模型組的大鼠缺血側(cè)腦皮質(zhì)層微血管中總NOS(TNOS)和誘生型NOS(iNOS)活力均顯著升高(P＜0.

16、01)，而原生型NOS(cNOS)活力顯著降低(P＜0.01)，顯示造模成功。與模型組相比，再灌注1d，葛根素注射液組(30.00 mg·kg-1)、尼莫地平組(2.00 mg·kg-1)、梓葛凍干粉針16.40 mg·kg-1、32.70 mg·kg-1和65.40 mg·kg-1組均顯著降低TNOS和iNOS活力(P＜0.05，P＜0.01);再灌注4d、7d和14d，各給藥組均能顯著降低TNOS、iNOS活力(P＜0.01)，且也

17、能顯著升高cNOS活力(P＜0.01)，提示梓葛凍干粉針有改善腦缺血/再灌注損傷大鼠微血管舒縮功能的效果。
　　與假手術(shù)組相比，模型組的大鼠缺血側(cè)腦皮質(zhì)層微血管中ET-1含量均升高(P＜0.01)，且隨著觀察時間延長而逐漸增多，顯示造模成功。再灌注1d，與模型組相比，梓葛凍干粉針32.70 mg·kg-1組能顯著降低大鼠缺血側(cè)腦皮質(zhì)層ET-1含量(P＜0.05);再灌注4、7和14d時，與模型組相比，梓葛凍干粉針各劑量組均能極顯著

18、降低大鼠缺血側(cè)腦皮質(zhì)層微血管中ET-1含量(P＜0.01)，提示其有減輕血管收縮和血管內(nèi)皮細胞損傷的作用。
　　再灌注1、4、7和14d時，與假手術(shù)組相比，模型組的大鼠缺血側(cè)腦皮質(zhì)層微血管中TXB2含量升高和6-Ke-to-PGF1α含量降低(P＜0.01)，顯示造模成功。而與模型組相比，梓葛凍干粉針16.40 mg·kg-1、32.70 mg·kg-1和65.40 mg·kg-1組能顯著抑制大鼠缺血側(cè)腦皮質(zhì)層TXB2含量升高和6

19、-Ke-to-PGF1α含量降低(P＜0.05，P＜0.01)，且能降低TXB2/6-Ke-to-PGF1比值(P＜0.01)，提示其有改善腦缺血/再灌注損傷大鼠微血管舒縮功能的效果。
　　(5)梓葛凍干粉針對腦缺血/再灌注大鼠的腦微循環(huán)中微血管通透性的影響
　　熒光定量PCR結(jié)果顯示，假手術(shù)組皮層腦組織中有少量MMP-9 mRNA表達，腦缺血再灌注后，各時間點（1、4、7和14d），與假手術(shù)組相比，模型組的大鼠缺血側(cè)腦皮質(zhì)

20、層微血管中MMP-9 mRNA表達均顯著升高(P＜0.01)，顯示造模成功。與模型組相比，梓葛凍干粉針16.40 mg·kg-1、32.70 mg·kg-1和65.40 mg·kg-1組均能顯著降低大鼠缺血側(cè)腦皮質(zhì)層微血管中MMP-9 mRNA表達水平(P＜0.05，P＜0.01);與假手術(shù)組相比，模型組的大鼠缺血側(cè)腦皮質(zhì)層微血管中Claudin-5mRNA、Occludin mRNA、ZO-1 mRNA表達均顯著降低，而與模型組相比，

21、梓葛凍干粉針各劑量組在相應(yīng)時間點能顯著增加大鼠缺血側(cè)腦皮質(zhì)層微血管中Claudin-5 mRNA、Occludin mRNA、ZO-1 mRNA表達(P＜0.05,P＜0.01)。
　　Western blot檢測蛋白結(jié)果與其基因水平結(jié)果基本一致。在再灌注1、4、7和14d，與假手術(shù)組相比，模型組的大鼠缺血側(cè)腦皮質(zhì)層微血管中MMP-9蛋白表達均顯著升高(P＜0.01)，顯示造模成功。與模型組相比，各給藥組均能顯著降低大鼠缺血側(cè)腦皮

22、質(zhì)層微血管中MMP-9蛋白表達(P＜0.01);與假手術(shù)組相比，模型組的大鼠缺血側(cè)腦皮質(zhì)層微血管中Claudin-5、Occludin、ZO-1蛋白水平均顯著降低，而與模型組相比，梓葛凍干粉針各劑量組在相應(yīng)時間點能顯著升高大鼠缺血側(cè)腦皮質(zhì)層微血管中Claudin-5、Occludin、ZO-1蛋白表達水平(P＜0.05，P＜0.01)，提示其有改善腦缺血/再灌注損傷大鼠微血管通透性的效果。
　　2.梓葛凍干粉針對高分子葡聚糖大鼠急

23、性腦微循環(huán)障礙的改善作用
　　與正常組相比，在考察相對應(yīng)的時間點，模型組的大鼠軟腦膜微動脈，微靜脈內(nèi)徑顯著縮小，且血流量呈顯著下降(P＜0.01)，顯示造模成功;與模型組相比，梓葛凍干粉針16.40 mg·kg-1、32.70 mg·kg-1和65.40 mg·kg-1組中大鼠軟腦膜的微動脈、微靜脈內(nèi)徑恢復(fù)顯著(P＜0.01)，且能使血流量在10 min以后基本恢復(fù)至造模前的血流量。與正常組相比，模型組的全血粘度、血漿粘度、紅細胞

24、壓積和紅細胞聚集指數(shù)均顯著升高，顯示造模成功;與模型組相比，梓葛凍干粉針65.40mg·kg-1組能顯著降低血液流變學(xué)的各項指標（P＜0.01）;梓葛凍干粉針16.40mg·kg-1和32.70 mg·kg-1組能顯著降低除紅細胞壓積以外的其它項血液流變學(xué)的指標(P＜0.05，P＜0.01)，提示梓葛凍干粉針具有對大鼠急性腦微循環(huán)障礙的改善作用。
　　3.梓葛凍干粉針對體外缺氧/復(fù)氧損傷大鼠腦微血管內(nèi)皮細胞mmp-9蛋白表達的影響

25、
　　MTT法結(jié)果顯示，梓葛凍干粉針作用于腦微血管內(nèi)皮細胞的IC50值為860μg·mL-1。缺氧/復(fù)氧損傷下，與正常對照組相比，復(fù)氧24 h后，模型組的BMECs細胞中MMP-9蛋白表達顯著升高(P＜0.01)，顯示造模成功。與模型組相比，梓葛凍干粉針24.50μg·mL-1、49.00μg·mL-1和98.00μg·mL-1可抑制BMECs缺氧/復(fù)氧損傷下MMP-9蛋白升高，提示其對血管內(nèi)皮細胞完整性具有保護作用。
　　

26、結(jié)論：
　　1.采用Longa線栓法制備腦缺血模型最佳的缺血/再灌注時間為缺血2h，模型穩(wěn)定，可控性和可重復(fù)性好。梓葛凍干粉針對腦缺血/再灌注損傷大鼠，能使腦血流在再灌注時緩慢恢復(fù)，減小腦梗死體積，減小腦組織含水量和EB含量，可以減輕腦水腫和血腦屏障的破壞程度;梓葛凍干粉針能促進缺血側(cè)大鼠皮層區(qū)CD31的表達，表明可促進腦缺血/再灌注損傷大鼠的血管新生;梓葛凍干粉針改善腦微循環(huán)可能與調(diào)節(jié)微血管舒縮功能，抑制iNOS的活化，減少TN

27、OS和ET-1的生成，抑制大鼠缺血側(cè)腦皮質(zhì)層TXB2和6-Ke-to-PGF1α表達有關(guān);同時，梓葛凍干粉針可抑制MMP-9mRNA及蛋白表達和促進Claudin-5、Occludin、ZO-1mRNA及蛋白表達，保護微血管完整性，降低微血管通透性，改善腦微循環(huán)。
　　2.梓葛凍干粉針對急性腦微循環(huán)障礙大鼠，可擴張腦微動靜脈管徑，逆轉(zhuǎn)腦血流量下降的趨勢和血液粘稠，提示梓葛凍干粉針具有對急性腦微循環(huán)障礙的改善作用。
　　3.梓