梓葛凍干粉針對腦缺血小鼠神經(jīng)功能和大鼠神經(jīng)干細胞增殖的影響.pdf

1、背景:
　　 “梓葛凍干粉針劑”為課題組創(chuàng)制的抗腦缺血中風的中藥新藥注射劑。其處方與制備方法已經(jīng)申請國家技術(shù)發(fā)明專利,該制劑主要藥效學研究已獲得重慶市科技攻關(guān)項目資助(CSTC,2010AC5011,徐曉玉主持)。前期已將葛根素、梓醇對腦缺血模型動物的改善作用進行了研究,該制劑對CoCl2所致的PC12細胞損傷的保護作用進行了研究。本文觀察了該制劑對腦缺血動物的神經(jīng)功能保護作用,能否促進腦缺血后神經(jīng)干細胞增殖和血管新生的作用,旨

2、在為原始創(chuàng)新藥物提供主要藥效學實驗依據(jù)。
　　 目的:
　　 探討梓葛凍干粉針的兩種主要原料葛根素與梓醇單用及配伍對局灶性腦缺血模型小鼠的神經(jīng)保護作用,以及梓葛凍干粉針對永久性腦缺血模型成年大鼠神經(jīng)干細胞增殖的影響。
　　 方法:
　　 1.梓醇、葛根素及其配伍對小鼠腦缺血損傷的保護
　　 (1)藥物對腦缺血小鼠氧化損傷的保護
　　 小鼠隨機分為假手術(shù)組,模型組,依達拉奉組,葛根素高、中、

3、低劑量組,梓醇高、中、低劑量組,和梓醇葛根素配伍高、中、低劑量組,于術(shù)前7d開始尾靜脈注射給藥,第7d線栓法制備小鼠永久局灶性大腦中動脈栓塞模型(PMCAO),造模后3h再次給藥,給藥1h后斷頭取腦,測定大腦中丙二醛(MDA)、一氧化氮(NO)的含量和超氧化物歧化酶(SOD)的活力。
　　 (2)藥物對腦缺血小鼠神經(jīng)功能及梗死體積的影響
　　 線栓法制備PMCAO模型,根據(jù)Longa評分結(jié)果,選取1～3分者,小鼠隨機分為

4、假手術(shù)組、模型組、梓醇中劑量、葛根素中劑量、梓醇葛根素配伍中劑量和依達拉奉4.5mg·kg-1組,各組給藥之前無顯著性差異(P＞0.05)。于術(shù)后3h開始給藥,此后每天尾靜脈注射給藥1次,連續(xù)7d,于缺血1、4和7d對小鼠神經(jīng)行為學,神經(jīng)綜合功能進行評分,于缺血第8d處死測定腦梗死體積。
　　 2.梓葛凍干粉針對腦缺血大鼠在體神經(jīng)干細胞增殖及血管新生的影響
　　 采用線栓法制備永久局灶性大腦中動脈栓塞模型(PMCAO),

5、按照Longa評分標準,將造模成功(1～2分者)的SD大鼠隨機分為假手術(shù)組,模型組,梓葛凍干粉針65.4mg·kg-1、32.7mg·kg-1和16.4mg·kg-1組,各組給藥之前無顯著性差異(P＞0.05),于模型成功后3h行尾靜脈注射給藥,以后每天給藥一次。在腦缺血后1、4和7d后的3個不同時間點處死動物,取大腦組織,免疫組織化學法檢測巢蛋白(Nestin)、5-溴脫氧尿嘧啶(BrdU)、血小板內(nèi)皮細胞黏附因子1(CD31)和血管

6、內(nèi)皮生長因子(VEGF)的表達情況。
　　 結(jié)果:
　　 1.梓醇、葛根素及其配伍對小鼠腦缺血損傷的保護
　　 (1)藥物對腦缺血小鼠抗氧化損傷的保護
　　 與假手術(shù)組相比,模型組腦勻漿中MDA和NO含量顯著升高(P＜0.01),SOD活性顯著降低(P＜0.01),顯示造模成功。與模型組相比,葛根素高劑量,梓醇高劑量,梓醇葛根素配伍高劑量、中劑量和低劑量組MDA含量極顯著降低(P＜0.01),葛根素中劑量

7、、低劑量組,梓醇中劑量組MDA含量顯著降低(P＜0.05);配伍高劑量和中劑量組NO含量極顯著降低(P＜0.01),葛根素高劑量和中劑量組,梓醇中劑量組NO含量顯著降低(P＜0.05);葛根素高、中、低劑量組,梓醇高劑量,配伍高、中、低劑量組SOD活性極顯著升高(P＜0.01),梓醇中、低劑量組SOD活性顯著升高(P＜0.05)。
　　 (2)藥物對腦缺血小鼠神經(jīng)功能及梗死體積的影響
　　 與假手術(shù)組相比,模型組和各給藥

8、組1、4和7d神經(jīng)行為學和神經(jīng)綜合功能數(shù)值極顯著升高(P＜0.01),顯示造模成功。與模型組相比,缺血4d和7d,葛根素中劑量組、梓醇中劑量組神經(jīng)行為學分值顯著降低(P＜0.05);配伍中劑量組神經(jīng)行為學分值極顯著降低(P＜0.01);缺血4d,葛根素中劑量組、梓醇中劑量組、配伍中劑量組神經(jīng)綜合功能分值顯著降低(P＜0.05);缺血7d,葛根素中劑量組、梓醇中劑量、神經(jīng)綜合功能分值顯著降低(P＜0.05),配伍中劑量組神經(jīng)綜合功能分值極

9、顯著降低(P＜0.01);梓醇中劑量、葛根素中劑量組梗死體積顯著減小(P＜0.05),配伍中劑量組梗死體積極顯著降低(P＜0.01)。
　　 2.梓葛凍干粉針對腦缺血大鼠在體神經(jīng)干細胞增殖及血管新生的影響
　　 (1)梓葛凍干粉針對腦缺血大鼠神經(jīng)干細胞增殖的影響
　　 造模3h后Longa評分在1～2分的SD大鼠174只,其中假手術(shù)組(18只),各給藥組39只,各劑量1、4和7d三個亞組各13只。與假手術(shù)組相比,

10、模型組神經(jīng)行為學,腦梗死體積顯著升高(P＜0.01),顯示造模成功,大鼠缺血側(cè)海馬DG區(qū)、SVZ和皮質(zhì)區(qū)BrdU和Nestin陽性細胞數(shù)顯著增加(P＜0.01)。腦缺血損傷1、4和7d時,BrdU和Nestin在缺血側(cè)不同腦區(qū)均有不等程度的表達。與模型組相比,梓葛凍干粉針65.4mg·kg-1能顯著提高缺血7d時DG區(qū)的細胞增殖(P＜0.01),梓葛凍干粉針65.4mg·kg-1和32.7mg·kg-1組能顯著提高缺血4d和7d時SVZ

11、和皮質(zhì)區(qū)的細胞增殖(P＜0.01);梓葛凍干粉針65.4mg·kg-1和32.7mg·kg-1組能顯著提高缺血4d和7d時Nestin在DG和皮質(zhì)區(qū)的表達(P＜0.01),顯著提高7d時SVZ的表達(P＜0.01)。
　　 (2)梓葛凍干粉針對腦缺血大鼠微血管密度和VEGF表達的影響
　　 造模3hLonga評分在1～2分的SD大鼠174只,其中假手術(shù)組(18只),各給藥組39只,各劑量1、4和7d亞組13只。與假手術(shù)組

12、相比,模型組神經(jīng)行為學,腦梗死體積顯著升高(P＜0.01),顯示造模成功,缺血側(cè)皮質(zhì)區(qū)MVD數(shù)量明顯增加(P＜0.01),缺血側(cè)海馬DG區(qū)、SVZ和皮質(zhì)區(qū)VEGF陽性細胞數(shù)明顯增加(P＜0.01)。缺血4d和7d,與模型組相比,梓葛凍干粉針65.4mg·kg-1和32.7mg·kg-1組能顯著增加海馬DG區(qū)、SVZ和皮質(zhì)區(qū)MVD的數(shù)量(P＜0.01);缺血1、4和7d時,梓葛凍干粉針65.4mg·kg-1能顯著提高VEGF在海馬DG區(qū)、