“腦神經(jīng)血管單元”體外模型的構(gòu)建及梓葛凍干粉對其缺氧缺糖損傷的保護研究.pdf

1、針對單一的細胞途徑治療缺血性腦損傷效果并不令人滿意，將腦組織的結(jié)構(gòu)和功能單位進行整體保護被認為是有效的治療策略，即保護“腦神經(jīng)血管單元”?！澳X神經(jīng)血管單元”是由微血管(這些血管的內(nèi)皮-基質(zhì)-星形細胞足突復(fù)合體是一個完整的部分)、血管周圍的星形細胞突起及由這些突起所支持的神經(jīng)元以及軸突共同組成的復(fù)合體。建立原代3細胞共培養(yǎng)的“腦神經(jīng)血管單元”體外模型，對于研究和篩選治療缺血性腦損傷新藥意義重大。
　　 目的:
　　 1.構(gòu)

2、建大鼠腦微血管內(nèi)皮細胞、腦星形膠質(zhì)細胞、腦神經(jīng)元3種腦細胞原代共培養(yǎng)的整體--“腦血管神經(jīng)單元”體外試驗?zāi)Ｐ?，用于腦血管疾病的研究和治療藥物的篩選。
　　 2.利用“腦血管神經(jīng)單元”體外試驗?zāi)Ｐ?，觀察梓葛凍干粉針對“腦神經(jīng)血管單元”的缺血缺氧損傷的整體保護效果，為創(chuàng)制中藥新藥提供主要藥效學(xué)依據(jù)。
　　 方法:
　　 1.借鑒并改良國外方法，分別進行大鼠腦微血管內(nèi)皮細胞、腦星形膠質(zhì)細胞、腦神經(jīng)元3種腦細胞原代單細胞

3、培養(yǎng)，方法如下。(1)分離新生2周左右的SD大鼠乳鼠腦皮層血管內(nèi)皮細胞，通過Ⅱ行膠原酶和胰酶配合使用消化組織細胞，25％牛血清白蛋白分離血管段，采用消化傳代法純化，免疫細胞化學(xué)和免疫熒光法檢測內(nèi)皮細胞特異性蛋白Ⅷ因子以鑒定細胞純度。(2)分離新生1-2 d內(nèi)的SD大鼠腦星型膠質(zhì)細胞，采用胰酶消化發(fā)獲得細胞，差速粘附法和振蕩培養(yǎng)法去除雜細胞以及免疫細胞化學(xué)和免疫熒光法檢測星形膠質(zhì)細胞特異性酸性膠質(zhì)纖維蛋白GFAP以鑒定細胞純度。(3)分離

4、新生24 h內(nèi)的SD新生鼠腦皮質(zhì)神經(jīng)元細胞，采用胰酶消化法和阿糖胞苷抑制劑來抑制雜細胞的生長而純化神經(jīng)元細胞，后利用免疫細胞化學(xué)和免疫熒光鑒定神經(jīng)元特異性烯醇化物酶NSE以鑒定細胞純度。
　　 2、借鑒并改良國外方法，建立由上述3種腦細胞共培養(yǎng)所組成的共同體--“腦神經(jīng)血管單元”模型，選用直徑12 mm、微孔孔徑0.4μm、微孔膜面積1.12 mm2的Transwell(12孔，No3401，Corning)小室或者直徑24 m

5、m、微孔孔徑0.4μm、微孔膜面積4.67 mm2的Transwell(6孔，No.3412，Corning)種植3種細胞，分別于孔板底部最先接種已純化生長7 d的神經(jīng)元，2 d后于膜的外側(cè)依靠張力作用接種傳代純化后的星形膠質(zhì)細胞，2 d后于膜的內(nèi)池接種的傳代純化后的血管內(nèi)皮細胞，相同條件下共培養(yǎng)7 d后。并通過以下指標(biāo)鑒定“腦血管神經(jīng)單元”體外模型：倒置顯微鏡觀察3種細胞的生長狀態(tài)、透射電鏡觀察模型內(nèi)皮細胞間的精密連接、熒光素鈉(FL

6、U)和辣根過氧化物酶(HRP)檢測模型的通透性以及外排系統(tǒng)γ-谷氨酰胺轉(zhuǎn)肽酶(γ-GT)以及細胞跨膜電阻(TEER)。
　　 3、構(gòu)建“腦神經(jīng)血管單元”缺氧缺糖損傷，并通過以下指標(biāo)觀察梓葛凍干粉對其損傷的整體保護作用，檢測指標(biāo)包括：westerblot檢測促紅細胞生成素(EPO)和促紅細胞生成素受體(EPOR)以及血管內(nèi)皮細胞生長因子(VEGF)、軸突生長蛋白(GAP-43)、髓過氧化物酶(MPO)、細胞間赫附分子-1(ICAM

7、-1)、白細胞介素1(IL-1α)、金屬基質(zhì)酶9(MMP-9)和核因子(NF-κB)P65和(IκB-α)蛋白和神經(jīng)修復(fù)相關(guān)蛋白(TGF-β1)的表達。免疫酶聯(lián)ELISA法檢測神經(jīng)細胞生長因子β(NGFβ)和炎癥因子如腫瘤細胞壞死因子(TNF-α)等。
　　 結(jié)果:
　　 1、經(jīng)鑒定證明3種腦細胞分別原代培養(yǎng)成功。(1)成功分離獲得原代腦血管內(nèi)皮細胞，傳至3代后免疫細胞化學(xué)鑒定Ⅷ因子陽性細胞胞漿成棕黃色，計算得純度達95

8、％，符合神經(jīng)元原代培養(yǎng)實驗要求。(2)成功分離獲得原代腦星形膠質(zhì)細胞，經(jīng)差速貼壁法結(jié)合振蕩搖瓶法處理后傳至3代后免疫細胞化學(xué)鑒定GFAP陽性細胞胞漿成棕黃色，純度達90％，符合星形膠質(zhì)細胞原代培養(yǎng)實驗要求。(3)成功分離獲得原代腦神經(jīng)元細胞，經(jīng)阿糖胞苷純化后免疫細胞化學(xué)鑒定NSE陽性細胞胞漿成棕黃色純度達85％，符合血管內(nèi)皮細胞原代培養(yǎng)實驗要求。
　　 2.試驗結(jié)果顯示3種腦細胞共培養(yǎng)生長良好，并且具有相互促進生長的作用。經(jīng)檢測

9、以下指標(biāo)鑒定證明“腦神經(jīng)血管單元”體外模型成功建立。熒光素鈉(FLU)和辣根過氧化物酶(HRP)通透性分別達到4632±168.79，3.62±0.14；細胞跨膜電阻(TEER)值為268.67±4.16(Ω cm2)；細胞外排系統(tǒng)γ-谷氨酰胺轉(zhuǎn)肽酶(γ-GT)活性為155.33±0.80。相關(guān)檢測指標(biāo)均符合參考血腦屏障模型評價標(biāo)準(zhǔn)。透射電鏡結(jié)果顯示血管內(nèi)皮細胞存在精密連接。
　　 3.梓葛凍干粉對缺氧缺糖損傷的“腦神經(jīng)血管單元

10、”中的炎癥因子腫瘤細胞壞死因子(TNF-α)、細胞間黏附分子-1(ICAM-1)、白細胞介素1(IL-1)、金屬基質(zhì)酶9(MMP-9)具有顯著的下調(diào)作用；能顯著促進腦微血管內(nèi)皮紅細胞生成素及其受體(EPO、EPOR)、血管內(nèi)皮細胞生長因子(VEGF)蛋白表達；顯著抑制核因子(NF-κB)P65和神經(jīng)修復(fù)相關(guān)蛋白(TGF-β1)以及細胞凋亡蛋白(casepse-3)的表達；顯著提高NF-κB抑制蛋白α(IκB-α)表達。
　　 結(jié)