破血化瘀法對缺血缺氧誘導(dǎo)的體外神經(jīng)細(xì)胞損傷模型神經(jīng)保護(hù)作用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：本實(shí)驗(yàn)采用體外培養(yǎng)的胎齡14-16d的胎鼠大腦皮層神經(jīng)元探討破血化瘀法對缺血缺氧誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用，同時(shí)探索最佳培養(yǎng)神經(jīng)元方法、造模條件、用藥量等，為進(jìn)一步的研究和應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。
　　方法：采用機(jī)械二次消化法培養(yǎng)胎鼠大腦皮層細(xì)胞，用含胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基促進(jìn)細(xì)胞貼附并生長，換液用神經(jīng)元專用培養(yǎng)液加B27及L-谷氨酰胺的方法對神經(jīng)元進(jìn)行原代培養(yǎng)，培養(yǎng)獲得較純的神經(jīng)元（免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定NSE陽性細(xì)胞大于90％）并采

2、用CCK-8法測定其生長曲線；通過模型組和陽性對照組的建立，用CCK-8法測定細(xì)胞活力以確立缺血缺氧損傷模型的建立；對培養(yǎng)至第7天的細(xì)胞進(jìn)行不同藥物濃度干預(yù)，并設(shè)立常氧對照組，用CCK-8法檢測細(xì)胞的存活率。應(yīng)用SPSS.17.0對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行t檢驗(yàn)與方差分析。
　　結(jié)果：1、采用10×105個(gè)/mL的濃度鋪板及神經(jīng)元專用培養(yǎng)液加B27及L-谷氨酰胺的培養(yǎng)基對胎鼠皮層的神經(jīng)細(xì)胞進(jìn)行原代培養(yǎng)，細(xì)胞生長穩(wěn)定，經(jīng)免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定，NSE

3、陽性細(xì)胞比例可達(dá)90%以上，且神經(jīng)元第6~8天生長穩(wěn)定，但是第9天開始出現(xiàn)生長衰退趨勢。2、造模條件為缺血缺氧12h，復(fù)氧12h的皮層神經(jīng)元缺血缺氧損傷模型組與正常組相比，存活率接近60%。3、抵當(dāng)湯2.5%、5%、10%組與模型組相比，存活率均提高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；抵當(dāng)湯5%組與陽性對照組相比，存活率提高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，陽性對照組間存活率無明顯變化，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。4、造模的同時(shí)

4、加PI3K/AKT信號傳導(dǎo)通路抑制劑LY294002后，存活率下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），其中加抵當(dāng)湯以后其存活率提高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。
　　結(jié)論：1、用孕14-16的大鼠胎鼠及Neurobasal神經(jīng)元專用培養(yǎng)液加B27及L-谷氨酰胺的方法可以培養(yǎng)出純度較高的神經(jīng)元，可用于研究神經(jīng)元的相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究。2、用EBSS代替培養(yǎng)液，用缺血缺氧罐代替?zhèn)鹘y(tǒng)培養(yǎng)箱，造模12h，復(fù)氧12h的方法可以建立一種簡便、穩(wěn)