自噬-溶酶體途徑在缺血缺氧性星形膠質(zhì)細(xì)胞損傷中的激活及在其細(xì)胞死亡中的作用.pdf

1、目的：觀察體內(nèi)和體外缺血缺氧性星形膠質(zhì)細(xì)胞自噬／溶酶體途徑的激活，探討自噬在缺血缺氧性星形膠質(zhì)細(xì)胞死亡中的作用。 方法：采用大鼠永久性大腦中動(dòng)脈阻塞(permanent middle cerebral artery)，occlusionpMCAo)方法，建立腦缺血的大鼠模型；采用原代培養(yǎng)的新生鼠皮層星形膠質(zhì)細(xì)胞氧糖剝奪(oxygen-glulcose deprivation，OGD)方法，建立腦缺血的細(xì)胞模型。利用透射電鏡和MD

2、C染色法觀察星形膠質(zhì)細(xì)胞中自噬和溶酶體的激活，免疫熒光法和WesternBlot法檢測(cè)體內(nèi)和體外缺血缺氧對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞中自噬、溶酶體和凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響，以及抑制自噬對(duì)這些蛋白表達(dá)的影響。LDH法檢測(cè)抑制自噬對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞乳酸脫氫酶漏出率的影響。 結(jié)果：透射電鏡顯示，大腦中動(dòng)脈阻塞1 h-3 h可見(jiàn)大鼠大腦缺血皮層星形膠質(zhì)細(xì)胞胞漿內(nèi)漿網(wǎng)擴(kuò)張，自噬小體形成，線粒體腫脹，6 h溶酶體被激活，24 h見(jiàn)凋亡存在；另一方面，原代培養(yǎng)

3、的星形膠質(zhì)細(xì)胞在OGD O．5 h-3 h可見(jiàn)胞漿內(nèi)大量空泡、自噬小泡形成，內(nèi)漿網(wǎng)擴(kuò)張，6 h溶酶體被激活，12 h可見(jiàn)星形膠質(zhì)細(xì)胞壞死或者凋亡。MDC染色發(fā)現(xiàn)星形膠質(zhì)細(xì)胞OGD 0.5 h后即有大量自噬囊泡出現(xiàn)，并持續(xù)至3 h達(dá)到高峰。免疫熒光法顯示大鼠pMcAO后與對(duì)照組相比，LC3的陽(yáng)性細(xì)胞增多；星形膠質(zhì)細(xì)胞OGD后LC3熒光顆粒較對(duì)照組多，給予自噬抑制劑3-MA(10mM)后LC3熒光強(qiáng)度顯著減弱。Western鋤Blot結(jié)果顯

4、示，星形膠質(zhì)細(xì)胞在OGD O h、0.5 h、1 h、3 h、6h、12h后，Beclin 1的表達(dá)水平在1 h就迅速升高，達(dá)到峰值(p<0.01)，隨后逐漸減弱；LC3的表達(dá)水平在短期內(nèi)迅速增高，3 h達(dá)到高峰(P<0.01)，6 h表達(dá)水平仍較高，但已開(kāi)始減弱(P<0.01)；cathepsin B和LAMP 2的表達(dá)水平均在6 h達(dá)到高峰(P<0.01)；Bcl-2的表達(dá)水平在OGD后逐漸降低(P<0.01)。另外Western

5、Blot結(jié)果顯示，給予3-MA(10 mM)能顯著降低星形膠質(zhì)細(xì)胞Lc3的表達(dá)(p<0.05). LDH結(jié)果顯示，3-MA(5、10、20 mM)能降低星形膠質(zhì)細(xì)胞OGD 3 h后LDH的漏出率(P<0.05)，且呈一定的劑量依賴(lài)性。 結(jié)論： 1.體內(nèi)和體外缺血缺氧性星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)自噬／溶酶體途徑激活，且早于凋亡和細(xì)胞壞死前發(fā)生。 2.3-MA對(duì)缺血缺氧的星形膠質(zhì)細(xì)胞有保護(hù)作用，提示自噬／溶酶體途徑的過(guò)度