自噬溶酶體途徑在熱習(xí)服保護(hù)熱射病腦損傷中的作用.pdf

1、研究背景及意義:
　　近年來，全球范圍內(nèi)熱浪發(fā)生頻率和強(qiáng)度逐年增加，每年數(shù)以千計(jì)的人群遭受熱應(yīng)激性疾病(Heat stress illness，HSI)的威脅。熱射病(heat stroke，HS)是一種最為嚴(yán)重的HIS，也被稱作重癥中暑，主要臨床表現(xiàn)為核心體溫(core temperature，Tc)增高達(dá)40℃以上，同時(shí)合并存在中樞神經(jīng)系統(tǒng)(center nerve system，CNS)異常以及多器官功能障礙。HS的死亡率非

2、常高，國內(nèi)外報(bào)道為10％-50％，嚴(yán)重威脅著人們的健康。軍人是熱射病的高發(fā)人群，每年均有因中暑而導(dǎo)致官兵傷亡的案例報(bào)道，尤其是在熱區(qū)部隊(duì)執(zhí)行任務(wù)時(shí)，HS的發(fā)病率可顯著升高，且由于部隊(duì)訓(xùn)練演習(xí)時(shí)常在野外條件，救治條件有限，若未得到及時(shí)有效的救治，死亡率可高達(dá)30％一50％。因此，預(yù)防HS等熱損傷，對(duì)維護(hù)熱環(huán)境軍事作業(yè)人員的健康，提高熱區(qū)部隊(duì)?wèi)?zhàn)斗力具有重要意義，也是熱區(qū)部隊(duì)常規(guī)衛(wèi)生保障的重要內(nèi)容之一。
　　熱習(xí)服(heat accli

3、mation，HA)是熱區(qū)部隊(duì)開展熱損傷預(yù)防的重要措施，且我國于1996年就頒發(fā)了《軍人耐熱鍛煉衛(wèi)生規(guī)程》，規(guī)定赴熱區(qū)和駐扎在熱區(qū)部隊(duì)執(zhí)行重大任務(wù)前必須進(jìn)行耐熱鍛煉。HA是指機(jī)體在長期反復(fù)的熱作用下出現(xiàn)的一系列適應(yīng)性反應(yīng)，表現(xiàn)在機(jī)體對(duì)熱的反射性調(diào)節(jié)機(jī)能更趨完善，各種生理機(jī)能達(dá)到一個(gè)新的水平，如出汗率增加而心率和中心體溫相對(duì)下降，代謝率降低，即機(jī)體散熱增加而產(chǎn)熱減少。中樞神經(jīng)系統(tǒng)損害是熱射病的主要臨床特征之一，也是熱射病神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥的主

4、要病理原因。有研究顯示，HA可減低神經(jīng)系統(tǒng)對(duì)損傷刺激的應(yīng)激性，但HA對(duì)HS導(dǎo)致的神經(jīng)損傷是否具有直接保護(hù)作用，目前相關(guān)研究報(bào)道較少。因此，探討HA對(duì)HS導(dǎo)致的腦損傷的神經(jīng)保護(hù)作用及可能的機(jī)制，對(duì)HS的預(yù)防和救治具有重要意義。
　　自噬(autophagy)是一種高度保守的細(xì)胞生物學(xué)行為，即細(xì)胞內(nèi)存在“自己吃自己(self-eating)”的現(xiàn)象。當(dāng)存在對(duì)細(xì)胞生存不利的誘發(fā)因素時(shí)，如細(xì)胞外的營養(yǎng)缺乏、缺血、缺氧、高熱等和細(xì)胞內(nèi)的蛋白

5、折疊錯(cuò)誤、蛋白質(zhì)聚集、代謝紊亂、細(xì)胞器衰老或破裂等，均可誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生自噬。自噬主要參與細(xì)胞內(nèi)大分子物質(zhì)的循環(huán)及再利用、受損細(xì)胞器的清除，在促進(jìn)細(xì)胞存活，維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)，保持細(xì)胞健康過程中起著重要作用。在神經(jīng)元中，通過自噬清除胞質(zhì)中有神經(jīng)毒性的蛋白聚集物，從而對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)損傷起到保護(hù)性作用。但目前研究顯示，當(dāng)自噬被過度激活或自噬上調(diào)不受控制時(shí)，自噬可通過激活凋亡途徑或由于細(xì)胞無法及時(shí)有效降解大量細(xì)胞內(nèi)容物而加速細(xì)胞死亡，稱為自噬性程序性細(xì)胞

6、死亡。HA與HS均是由外界高溫環(huán)境刺激產(chǎn)生的，不同的是形成HA的條件是長時(shí)間反復(fù)的溫和熱刺激，而形成HS的條件是在短時(shí)間內(nèi)遭受了致死性高強(qiáng)度熱刺激，而HA與HS對(duì)機(jī)體產(chǎn)生的生理效應(yīng)完全不同，由此我們推測(cè)這兩種不同程度的熱刺激對(duì)自噬的影響也并不相同，且其誘導(dǎo)的自噬變化在HA及HS的病理生理調(diào)節(jié)中的作用和機(jī)制可能也不相同。
　　在自噬發(fā)生過程中，自噬體包裹需要降解的內(nèi)容物后與溶酶體融合形成自噬溶酶體，利用溶酶體內(nèi)的組織蛋白酶和水解酶進(jìn)

7、行降解消化，最終實(shí)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)循環(huán)。由此可見，溶酶體的功能在自噬過程中起著關(guān)鍵作用，而細(xì)胞遭受應(yīng)激發(fā)生損傷時(shí)，也可能累及到溶酶體的功能。那么，在熱習(xí)服和熱射病兩種不同強(qiáng)度的應(yīng)激狀態(tài)下，溶酶體的功能是否有差異及其與自噬調(diào)節(jié)有怎樣的關(guān)系，目前研究尚未闡述清楚。
　　因此，本課題通過探討HA對(duì)HS導(dǎo)致的腦損傷的保護(hù)作用及自噬溶酶體途徑在其中所發(fā)揮的作用，以揭示HA神經(jīng)保護(hù)作用的機(jī)制，為HS的防治提供新的參考依據(jù)。
　　研究方法:<

8、br>　　1.采用8周齡健康雄性C57BL/6小鼠在（34.5±1.0）℃、濕度（70±5）％條件下連續(xù)暴露30d建立HA小鼠模型，在（43±0.5）℃、濕度(70±5)％條件下暴露120min建立HS小鼠模型。將小鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組(CON組)、熱習(xí)服組(HA組)、熱射病組(HS組)和熱習(xí)服+熱射病組(HA+HS組)。
　　2.通過觀察不同組別小鼠的一般行為學(xué)、肛溫變化、腦組織含水量、腦組織病理改變和神經(jīng)細(xì)胞變性與凋亡情況，探

9、討熱習(xí)服對(duì)熱射病腦損傷的保護(hù)作用。
　　3.通過觀察不同組別小鼠腦組織的自噬相關(guān)蛋白LC3和Beclin-1的表達(dá)和自噬體形成情況，并應(yīng)用自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine，3MA)進(jìn)行干預(yù)，探討自噬在熱習(xí)服對(duì)熱射病腦損傷保護(hù)作用中的影響。
　　4.通過檢測(cè)不同組別小鼠腦組織的溶酶體相關(guān)膜蛋白1(LAMP-1)和組織蛋白酶B(Cathepsin B)的表達(dá)和活性情況，探討溶酶體功能在自噬調(diào)節(jié)中的作用。<

10、br>　　結(jié)果:
　　1.采用（34.5±1.0）℃、濕度（70±5）％連續(xù)暴露30d和（43±0.5）℃、濕度（70±5）％暴露120min可分別建立HA小鼠模型和HS小鼠模型，為后續(xù)研究提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　2.熱習(xí)服對(duì)熱射病導(dǎo)致的腦損傷具有保護(hù)作用，主要表現(xiàn)在:經(jīng)HA預(yù)處理后，接受43℃高溫暴露時(shí)，小鼠的一般行為狀態(tài)較好，耐熱能力顯著增強(qiáng)，其最高肛溫、死亡率、腦組織含水量、神經(jīng)細(xì)胞病理損傷程度以及神經(jīng)細(xì)胞的凋亡和變性程

11、度均顯著低于未經(jīng)HA預(yù)處理的小鼠，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P＜0.05)，HA組小鼠的上述指標(biāo)與CON組小鼠相比，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P＞0.05)。結(jié)果說明HA對(duì)HS導(dǎo)致的中樞神經(jīng)損傷具有明顯的保護(hù)作用，且HA本身對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)未產(chǎn)生損害效應(yīng)。
　　3.與CON組相比，HA組、HS組和HA+HS組的自噬相關(guān)蛋白LC3和Beclin-1的表達(dá)和自噬體形成均顯著升高，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P＜0.05)，提示熱刺激可誘導(dǎo)小鼠中樞神經(jīng)

12、細(xì)胞自噬增強(qiáng)。與HS組相比，HA+HS組的自噬相關(guān)蛋白LC3和Beclin-1的表達(dá)和自噬體形成均明顯下降，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P＜0.05)，提示熱習(xí)服預(yù)處理下調(diào)了HS組損傷性熱刺激誘導(dǎo)的自噬水平。應(yīng)用自噬抑制劑3MA后，3MA組和HA+3MA組的自噬水平受到了抑制，但腦組織含水量、神經(jīng)元變性和凋亡程度未發(fā)生明顯改變，提示3MA本身不會(huì)造成腦組織損傷;HA+3MA+HS12h組的自噬水平受到了抑制，但其腦組織含水量顯著升高、神經(jīng)元

13、變性和凋亡程度明顯加重，提示抑制自噬后，HA預(yù)處理對(duì)HS導(dǎo)致的腦損傷保護(hù)作用減弱;3MA+HS12h的自噬水平仍然維持在較高水平，且其腦組織含水量、神經(jīng)元變性情況和凋亡情況與HS組比較均未發(fā)生明顯改變，提示自噬抑制劑對(duì)HS12h組小鼠的自噬程度和損傷效應(yīng)未發(fā)揮明顯作用。
　　4.HA組小鼠腦組織細(xì)胞中溶酶體相關(guān)膜蛋白-1(LAMP-1)和組織蛋白酶B(Cathepsin B)的表達(dá)量與活性均略高于CON組，而HS組的LAMP-1和

14、Cathepsin B的表達(dá)量與活性均顯著低于CON組P＜0.05），提示損傷性高溫刺激可破壞溶酶體的結(jié)構(gòu)和酶的活性，從而影響溶酶體的功能。與HS組相比，HA+HS組中的LAMP-1和Cathepsin B的表達(dá)量與活性明顯升高，尤其是在恢復(fù)早期，差異更為明顯，提示熱習(xí)服預(yù)處理減輕了熱射病對(duì)溶酶體的損傷。
　　全文結(jié)論:
　　1.熱習(xí)服對(duì)熱射病腦損傷具有保護(hù)作用;
　　2.熱習(xí)服通過調(diào)節(jié)損傷性熱刺激誘導(dǎo)的自噬水平對(duì)熱射