熱習(xí)服上調(diào)Treg細(xì)胞減輕小鼠熱應(yīng)激損傷的研究.pdf

1、目的:
　　熱應(yīng)激損傷是指機(jī)體在持續(xù)的熱應(yīng)激作用下，發(fā)生的一系列應(yīng)激性生理變化和病理性的損傷，俗稱中暑，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)中的熱痙攣、熱衰竭、熱射病等，均屬于熱應(yīng)激損傷，多見于持續(xù)的熱環(huán)境暴露或高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)，不僅影響在熱環(huán)境下的作業(yè)能力，更對(duì)機(jī)體的健康造成嚴(yán)重危害。其主要的發(fā)生機(jī)制是由于機(jī)體從外界熱環(huán)境獲得的熱量和自身產(chǎn)熱之和，超出了機(jī)體的最大散熱效率，熱量逐漸蓄積無法散失，導(dǎo)致下丘腦體溫調(diào)節(jié)中樞調(diào)控失能，機(jī)體核心體溫被動(dòng)升高，內(nèi)臟血流大量向

2、皮膚轉(zhuǎn)移，各臟器功能紊亂，細(xì)胞發(fā)生缺血缺氧損傷，釋放多種物質(zhì)激活炎癥相關(guān)信號(hào)通路，誘導(dǎo)急性系統(tǒng)性炎癥的發(fā)生，而過度激烈的炎癥反應(yīng)的發(fā)生，又對(duì)臟器造成了更嚴(yán)重的損傷，以至于可進(jìn)一步發(fā)展為多器官衰竭綜合征，甚至導(dǎo)致死亡。
　　熱習(xí)服(heat acclimation，HA)是機(jī)體在長(zhǎng)期的熱環(huán)境暴露后，身體組織在各個(gè)水平達(dá)到一個(gè)新的穩(wěn)態(tài)，產(chǎn)生一系列有利于適應(yīng)熱環(huán)境，提高耐熱能力的變化;機(jī)體在形成熱習(xí)服后，能夠防止熱應(yīng)激損傷的發(fā)生，或降低

3、熱應(yīng)激損傷的嚴(yán)重程度。熱習(xí)服后熱耐受能力提高的機(jī)制復(fù)雜，尚不完全明確，已有大量的相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，熱習(xí)服提高熱耐受、減輕熱應(yīng)激損傷的原理包括熱習(xí)服后基礎(chǔ)代謝率降低、血容量增加、排汗功能改善、心血管系統(tǒng)功能增強(qiáng)、對(duì)汗液中鈉離子的重吸收增強(qiáng)等;而在后期的全身炎癥反應(yīng)發(fā)生期間，熱習(xí)服是否也存在相應(yīng)的機(jī)制減輕炎癥的發(fā)生，從而降低損傷程度，目前尚不清楚。
　　在本研究中，對(duì)熱習(xí)服小鼠的外周免疫器官中免疫細(xì)胞亞群進(jìn)行了分析，最后以調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(r

4、egulatory T cell，Treg)對(duì)炎癥的負(fù)調(diào)控作用為切入點(diǎn)，探究了熱習(xí)服對(duì)熱應(yīng)激損傷的保護(hù)作用與Treg細(xì)胞的關(guān)系，并對(duì)其機(jī)制進(jìn)行了初步的研究探討，為探明熱習(xí)服提高機(jī)體熱耐受、減輕熱應(yīng)激損傷的免疫機(jī)制研究提供思路。
　　方法:
　　1.建立熱習(xí)服小鼠模型，初步明確熱習(xí)服提高小鼠熱耐受與免疫細(xì)胞亞群的改變。
　　2.分選未熱習(xí)服小鼠脾臟、淋巴結(jié)的Treg細(xì)胞，尾靜脈輸入同樣未熱習(xí)服的小鼠，觀察Treg細(xì)胞的輸

5、入對(duì)熱應(yīng)激環(huán)境下小鼠生存率的影響，進(jìn)行組織病理切片對(duì)比臟器損傷情況，探討Treg細(xì)胞的上升是否對(duì)熱應(yīng)激損傷具有保護(hù)作用。
　　3.引入Treg細(xì)胞缺陷的microRNA-155(Mir-155)基因敲除小鼠，與普通小鼠在同樣熱應(yīng)激下的死亡情況進(jìn)行對(duì)比，明確Treg細(xì)胞缺乏是否降低小鼠熱應(yīng)激耐受。并對(duì)熱應(yīng)激小鼠的脾臟中性粒細(xì)胞和Treg進(jìn)行流式細(xì)胞檢測(cè)細(xì)胞頻率，進(jìn)一步明確Treg細(xì)胞與熱應(yīng)激損傷程度的相關(guān)性。
　　4.通過流式

6、細(xì)胞術(shù)檢測(cè)熱習(xí)服和未熱習(xí)服小鼠在熱應(yīng)激下血液中性粒細(xì)胞頻率變化情況，以及脾臟中性粒細(xì)胞與Treg細(xì)胞頻率，分析脾臟Treg細(xì)胞頻率與中性粒細(xì)胞頻率的相關(guān)性。
　　5.通過免疫組化對(duì)脾臟叉頭狀轉(zhuǎn)錄因子3(forkhead box protein-3，F(xiàn)oxp3)和程序性死亡受體-配體1(programmed cell death-Ligand1，PD-L1)分子表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，細(xì)胞共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證Treg與中性粒細(xì)胞之間的相互作用，對(duì)熱

7、習(xí)服提高機(jī)體熱耐受的機(jī)制進(jìn)行初步研究。
　　結(jié)果:
　　1.對(duì)熱習(xí)服小鼠和未熱習(xí)服小鼠的主要免疫細(xì)胞分群進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)熱習(xí)服小鼠Treg細(xì)胞在脾臟、淋巴結(jié)中頻率明顯上調(diào)。
　　2.通過對(duì)比同樣熱應(yīng)激下熱習(xí)服小鼠與未熱習(xí)服小鼠存活情況，發(fā)現(xiàn)未熱習(xí)服組小鼠死亡率更高、臟器受損程度更為明顯，推測(cè)熱習(xí)服提高小鼠的熱耐受與Treg細(xì)胞上調(diào)有關(guān)。
　　3.采用流式分選獲取未熱習(xí)服小鼠脾臟、淋巴結(jié)的Treg細(xì)胞，尾靜脈輸入同樣

8、未熱習(xí)服的小鼠，發(fā)現(xiàn)小鼠在熱應(yīng)激下的死亡率顯著降低，臟器損傷也有所減輕，證明Treg細(xì)胞輸入能夠達(dá)到類似于熱習(xí)服的效果，減輕熱應(yīng)激損傷的嚴(yán)重程度。
　　4.Treg細(xì)胞缺陷的Mir-155基因敲除小鼠和普通小鼠進(jìn)行熱應(yīng)激實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)Mir-155基因敲除小鼠在同樣強(qiáng)度熱應(yīng)激下的死亡率更高，進(jìn)一步證實(shí)了Treg細(xì)胞與熱應(yīng)激損傷的相關(guān)性。
　　5.對(duì)高熱應(yīng)激后脾臟中性粒細(xì)胞頻率與Treg細(xì)胞頻率進(jìn)行相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)呈良好的負(fù)相關(guān)，

9、推測(cè)Treg細(xì)胞能夠抑制急性炎癥反應(yīng)中的中性粒細(xì)胞募集，從而減輕熱應(yīng)激下臟器損傷程度。
　　6.免疫組化分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與未熱習(xí)服小鼠相比，熱習(xí)服小鼠脾臟PD-L1和foxp3分子顯著上調(diào)，提示熱習(xí)服能夠上調(diào)PD-L1和Foxp3的表達(dá)，從而誘導(dǎo)Treg細(xì)胞的增加，發(fā)揮更強(qiáng)的免疫負(fù)調(diào)控作用。
　　7.細(xì)胞共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Treg細(xì)胞與中性粒細(xì)胞共培養(yǎng)體系中，熱刺激誘導(dǎo)的髓過氧化物酶釋放減少，提示Treg細(xì)胞能夠抑制中性粒細(xì)胞的活

10、化;通過阻斷不同的信號(hào)通路，對(duì)其機(jī)制進(jìn)行初步探討，發(fā)現(xiàn)Treg主要通過PD-1/PD-L1信號(hào)通路抑制中性粒細(xì)胞的活化。
　　結(jié)論:
　　研究檢測(cè)了小鼠在形成熱習(xí)服后，外周免疫器官的各種免疫細(xì)胞的頻率變化，發(fā)現(xiàn)Treg細(xì)胞頻率有所上調(diào)，熱習(xí)服提高機(jī)體熱耐受的機(jī)制可能與Treg細(xì)胞對(duì)急性炎癥的負(fù)調(diào)控作用相關(guān)。熱習(xí)服能夠誘導(dǎo)小鼠脾臟Treg細(xì)胞頻率上調(diào)，可能與熱習(xí)服后PD-L1分子、Foxp3分子的上調(diào)有關(guān)，Treg上調(diào)可減輕熱