吸入性損傷中熱應(yīng)激對(duì)呼吸道的損傷及其機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　在明確熱應(yīng)激能夠引起線(xiàn)粒體改變和產(chǎn)生ROS基礎(chǔ)上，著重研究在炎癥反應(yīng)中MCU如何感受ROS作用并調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝，闡明了新的機(jī)制，為臨床燒傷吸入性損傷治療提供新的靶點(diǎn)和機(jī)制。
　　第一部分 CFTR調(diào)節(jié)的MAPK/NF-κ通路在熱力性損傷肺部炎癥的作用
　　方法:
　　1.建立體外細(xì)胞升溫模型，52℃處理5分鐘，熱處理后在0小時(shí)，8小時(shí)，1天，2天，5天，RealtimePCR和蛋白電泳檢測(cè)CFTR和CO

2、X2的表達(dá)變化。
　　2.建立大鼠體內(nèi)動(dòng)物吸入性損傷模型，熱處理后0小時(shí)，8小時(shí)，1天，2天，5天，免疫組化和蛋白電泳檢測(cè)CFTR和COX2的表達(dá)變化。
　　3.體外細(xì)胞升溫模型中，熱處理后在0小時(shí)，8小時(shí)，1天，2天，5天，蛋白電泳檢測(cè)MAPK和p-Iκ Bα的表達(dá)變化。細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)NF-κB定位變化。
　　4.體外細(xì)胞升溫模型中，NF-κB抑制劑(BAY11) ERK抑制劑(PD98059)及JNK抑制劑(SP

3、600125)處理16HBE細(xì)胞4小時(shí)，然后再進(jìn)行熱處理。Realtime-PCR和蛋白電泳檢測(cè)COX2的表達(dá)變化。ELISA檢測(cè)細(xì)胞上清液中炎癥因子PGE2的變化。
　　結(jié)果:
　　1.體外細(xì)胞升溫模型中，溫度處理后，CFTR的蛋白在0小時(shí)，8小時(shí)，1天，2天表達(dá)降低，1天時(shí)下降到最點(diǎn)，而于5天時(shí)表達(dá)到正常水平。COX2的蛋白表達(dá)呈現(xiàn)出持續(xù)上升，1天時(shí)達(dá)到最高點(diǎn)。
　　2.大鼠體內(nèi)動(dòng)物吸入性損傷模型中，肺部組織支氣管

4、細(xì)胞CFTR的表達(dá)在8小時(shí)和1天的時(shí)候表達(dá)逐漸降低，而對(duì)應(yīng)的時(shí)間點(diǎn)COX2的表達(dá)逐漸升高。在第5天CFTR及COX2表達(dá)均恢復(fù)到了正常。
　　3.熱處理后能夠激活PERK，PJNK的表達(dá)，并且在0小時(shí)達(dá)到最高峰。而對(duì)ERK，JNK和P38，PP38沒(méi)有影響。而蛋白p-Iκ Bα的表達(dá)在0小時(shí)，8小時(shí)，5天沒(méi)有明顯變化，而在1天和2天時(shí)達(dá)到了最高峰。免疫熒光結(jié)果顯示，在1天和2天的時(shí)候，NF-κB的表達(dá)從細(xì)胞核外轉(zhuǎn)移到了細(xì)胞核內(nèi)。<

5、br>　　4.在蛋白水平，單獨(dú)或者混合使用BAY11，PD98059，SP600125抑制劑分別能夠炎癥因子COX2的上升。ELISA結(jié)果表明，單獨(dú)或者混合使用BAY11，PD98059，SP600125抑制劑分別能夠抑細(xì)胞分泌的炎癥因子PGE2。說(shuō)明ERK，JNK以及NF-κB在熱引起的炎癥通路是在一條通路上起著關(guān)鍵作用。
　　5.在正常16HBE細(xì)胞中，Rib轉(zhuǎn)染組降低CFTR的表達(dá)后，Rib轉(zhuǎn)染組COX2 RNA表達(dá)也明顯高

6、于PEF組。蛋白電泳結(jié)果也顯示CFTR的下調(diào)表達(dá)激活了COX2，NF-κB，PERK，PJNK的表達(dá)。并且ERK，JNK，NF-κB的特異性抑制劑(BAY11，PD98059,SP600125)能夠降低CFTR下調(diào)后炎癥因子COX2和PGE2的上升表達(dá)。
　　6.蛋白電泳結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)CFTR(p-hCFTR)和VX-809處理組（1um或者3um）都能夠使熱刺激后的CFTR表達(dá)回升，也能夠降低在升溫后COX2的表達(dá)。ELISA

7、結(jié)果也顯示，升溫后的PGE2在VX809（1um或者3um）處理后也明顯降低。
　　7.在細(xì)胞升溫模型中，ERK，JNK特異性抑制劑(PD98059，SP600125)能夠降低熱應(yīng)激引起的p-IκBα上升，NF-κB的特異性抑制劑(BAY11)對(duì)熱應(yīng)激引起的P-ERK及P-JNK升高沒(méi)有影響。
　　8.Realtime PCR和Elisa結(jié)果顯示，細(xì)胞升溫后和RIB質(zhì)粒（降低CFTR的表達(dá)）轉(zhuǎn)染后，炎癥因子IL-8明顯上升，

8、并且，ERK，JNK，NF-κB，COX2的特異性抑制劑(BAY11，PD98059，SP600125，NS-398)能夠降低IL-8的表達(dá)。VX809也能夠降低熱引起的IL-8炎癥因子的分泌。
　　9.體外熱處理16HBE細(xì)胞，處理前及處理后0.5小時(shí)，8小時(shí)用姜黃素處理細(xì)胞，姜黃素能夠降低炎癥因子PGE2，IL-8的分泌。同時(shí)，我們用姜黃素治療吸入性損傷的大鼠，HE結(jié)果顯示，姜黃素能夠明顯降低熱引起的炎癥反應(yīng)。通過(guò)髓過(guò)氧化物(

9、MPO)免疫組化發(fā)現(xiàn)姜黃素處理組的髓過(guò)氧化物酶(MPO)陽(yáng)性細(xì)胞明顯少于升溫組。
　　10.在大鼠體內(nèi)動(dòng)物吸入性損傷模型中，鼻腔滴入姜黃素10mg/kg/天，免疫組化結(jié)果和蛋白電泳結(jié)果表明，姜黃素能夠升高吸入性損傷中降低的CFTR表達(dá)，而同時(shí)也能夠降低COX2的表達(dá)，最終能夠降低IL-8和PGE2的分泌。
　　第二部分 熱通過(guò)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和自噬誘導(dǎo)呼吸道上皮細(xì)胞炎癥
　　方法:
　　1.在體外細(xì)胞升溫模型中，用活性

10、氧的清除劑(NAC)處理16HBE細(xì)胞，蛋白電泳檢測(cè)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的蛋白GRP78和CHOP和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路PERK/eIF2α的變化。再用活性氧的清除劑(NAC)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的抑制劑(GSK2656157)，eLF2α siRNA以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激激活劑衣霉素(tunicamycin)處理16HBE細(xì)胞，蛋白電泳檢測(cè)LC3，P62，Beclin1的變化。
　　2.分別用活性氧的清除劑(NAC)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的抑制劑(GSK2656157)

11、，eLF2αsiRNA，CHOP siRNA以及ATF4 siRNA抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，Beclin1 siRNA，和ATG5 siRNA分別抑制自噬反應(yīng)，Realtime-PCR和ELISA檢測(cè)熱引起的炎癥因子的變化。
　　結(jié)果:
　　1.體外細(xì)胞升溫模型中，16HBE細(xì)胞內(nèi)受到熱應(yīng)激后，在0h，12h以及1d的時(shí)候，活性氧含量都明顯升高。但第2天的活性氧含量水平確又恢復(fù)至正常。
　　2.熱刺激能夠引起細(xì)胞內(nèi)的GRP78

12、和CHOP表達(dá)升高，而且在第12小時(shí)的時(shí)候達(dá)到高峰，其水平第2天逐漸降到正常。磷酸化的PERK和elF2α同樣在第12小時(shí)達(dá)到高峰，并且在第2天逐漸恢復(fù)。然而，IRE1，XBP1s和ATF6的蛋白表達(dá)在熱刺激后并沒(méi)有明顯變化。
　　3.熱應(yīng)激后，自噬的指標(biāo)LC3Ⅱ/LC3Ⅰ和Beclin1在第1天和第二天明顯升高，并在第5天將到正常水平。相反，P62的表達(dá)隨著溫度處理的時(shí)間逐漸降低，在第1天和2天達(dá)到最低值，而在第5天達(dá)到最高值。

13、激光共聚焦結(jié)果也顯示，自噬流在熱處理后的第1天和2天也明顯升高，而第5天降至正常范圍。
　　4.熱應(yīng)激后，Realtime-PCR結(jié)果顯示，在細(xì)胞RNA水平上，TNF-α，IL-6，IL-10，TGF-β的RNA表達(dá)在第1天和2天上升到最高值，第5天逐漸回復(fù)到了正常。在細(xì)胞培養(yǎng)上清中，TNF-α, IL-6，IL-10，TGF-β在第1天和第2天明顯升高，并且在第5天恢復(fù)至正常。
　　5.熱應(yīng)激后，活性氧的清除劑(NAC)能

14、夠降低內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的蛋白GRP78和CHOP的表達(dá)記憶內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路PERK/eIF2α的激活?；钚匝醯那宄齽?NAC)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的抑制劑(GSK2656157)，eLF2α siRNA能夠抑制熱應(yīng)激引起的LC3Ⅱ/LC3Ⅰ，Beclin1增加以及P62表達(dá)減少。
　　6.Realtime-PCR和ELISA結(jié)果顯示，NAC，GSK2656157，eLF2α siRNA，CHOP siRNA，ATF4 siRNA，Beclin1

15、siRNA，和ATG5 siRNA能夠減輕熱應(yīng)激刺激16HBE引起的TNF-α，IL-6，IL-10，TGF-β的RNA表達(dá)和細(xì)胞因子分泌。
　　第三部分 熱通過(guò)激活線(xiàn)粒體鈣通道蛋白(MCU)引起支氣管上皮細(xì)胞凋亡
　　方法:
　　建立體外細(xì)胞升溫模型，在受熱刺激后的0小時(shí)，1天，2天以及5天的時(shí)候，用CCK8檢測(cè)細(xì)胞活力。流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡。蛋白電泳檢測(cè)檢測(cè)凋亡蛋白Bcl2及Bax。
　　結(jié)果:
　　

16、1.細(xì)胞活力在熱處理后的第1，2天明顯降低，在第5天恢復(fù)至正常。細(xì)胞流式結(jié)果顯示凋亡細(xì)胞的比例在熱處理后第1，2天達(dá)到最高峰，在第5天降至正常。Bcl-2/Bax比例在熱處理后的第1天和2天降到最低值，第5天也恢復(fù)至正常。
　　2.激光共聚焦顯示熱刺激能使線(xiàn)粒體呈現(xiàn)應(yīng)激狀態(tài)，線(xiàn)粒體形狀由線(xiàn)狀長(zhǎng)條狀變成圓狀，并且排列松散。
　　3.熱處理后16HBE細(xì)胞內(nèi)的Ca2+熒光強(qiáng)度明顯高于未處理組。
　　4.熱處理后，會(huì)使細(xì)胞的

17、ATP代謝明顯降低。
　　5.熱處理組mitoSOX染色明顯高于未處理組。
　　6.熱處理后，會(huì)使細(xì)胞線(xiàn)粒體膜電位明顯降低和線(xiàn)粒體通透性轉(zhuǎn)換孔開(kāi)放，用RU360抑制劑或者線(xiàn)粒體ROS抑制劑Mito Tempo處理后，線(xiàn)粒體膜電位明顯升高和線(xiàn)粒體通透性轉(zhuǎn)換孔開(kāi)放程度降低。
　　7.RU360或Mito Tempo處理后，細(xì)胞活力明顯上升，細(xì)胞凋亡減少，Bcl-2/Bax比例降低。
　　全文總結(jié):
　　1.在1

18、6HBE細(xì)胞受到熱刺激以及吸入性損傷動(dòng)物模型中，熱刺激能夠引起炎癥因子COX2和PGE2上升。也能夠引起炎癥的TNF-α，IL-6，IL-10，TGF-β產(chǎn)生。
　　2.熱應(yīng)激通過(guò)CFTR/MAPK/NF-κB/COX2信號(hào)通路調(diào)節(jié)炎癥因子的產(chǎn)生。
　　3.熱應(yīng)激通過(guò)ROS/內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激/自噬信號(hào)通路調(diào)節(jié)炎癥因子的產(chǎn)生。
　　4.熱應(yīng)激能夠通過(guò)激活MCU，進(jìn)而引起細(xì)胞線(xiàn)粒體鈣超載，線(xiàn)粒體膜電位降低以及能量代謝改變引起細(xì)胞