miR-146a在煙霧吸入性損傷中調(diào)控作用的研究.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、目的:
  煙霧吸入性損傷的病死率高,發(fā)病機(jī)制復(fù)雜,主要是肺內(nèi)炎癥細(xì)胞膜上的NF-κB信號通路激活,誘導(dǎo)大量細(xì)胞因子釋放,促使炎癥反應(yīng)失控,導(dǎo)致ALI/ARDS的發(fā)生。miRNA是一類非編碼單鏈小分子RNA,可識別結(jié)合靶基因的3ˊ-UTR,導(dǎo)致mRNA降解或抑制翻譯。miR-146a通過靶向TRAF6和IRAK1阻斷NF-κB活化,負(fù)向調(diào)控炎癥反應(yīng)。一個miRNA可以調(diào)控多個靶基因,在煙霧吸入性損傷發(fā)生發(fā)展過程中, miR-146

2、a是否靶定TMEM33來減輕肺內(nèi)炎癥反應(yīng),國內(nèi)外未見報道?;诖?,本實驗依據(jù)miR-146a預(yù)測靶點構(gòu)建熒光素酶報告基因重組質(zhì)粒并進(jìn)行功能驗證,通過小鼠煙霧損傷模型觀察miR-146a對炎癥因子和蛋白表達(dá)水平的影響,試圖證實miR-146a通過靶向TMEM33減輕肺部炎癥反應(yīng),提高ALI/ARDS的治療效果。
  方法:
  1.利用生物學(xué)軟件TargetScan和miRanda預(yù)測TMEM33 mRNA3ˊ-UTR區(qū)可能是

3、miR-146a的作用靶點,構(gòu)建含TMEM33 mRNA3ˊ-UTR熒光報告質(zhì)粒,雙熒光素酶活性檢測驗證miR-146a與TMEM33的標(biāo)靶關(guān)系;
  2.選擇SPF級C57小鼠20只,雌雄不限,建立小鼠煙霧吸入性損傷模型,隨機(jī)分為正常對照組、煙霧致傷+生理鹽水組、煙霧致傷+miR-146a組、煙霧致傷+miR-control組,每組5只,煙霧吸入性損傷24h后處死小鼠取肺組織,右肺采用HE染色檢測肺損傷程度;采用探針PCR檢測各

4、組miR-146a的相對表達(dá)量,采用熒光定量PCR檢測各組TNF-α、IL-1和靶基因mRNA的表達(dá);左肺行Western實驗檢測各組COX-2和TMEM33蛋白的水平。
  結(jié)果:
  1. TargetScan等軟件預(yù)測顯示miR-146a與TMEM33mRNA3ˊ-UTR存在互補(bǔ)結(jié)合位點,構(gòu)建的熒光素酶報告質(zhì)粒經(jīng)酶切及測序鑒定正確;雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)顯示,與pMIR-TMEM33+miR-control組相比,

5、pMIR-TMEM33+miR-146a mimics組熒光素酶活性降低62%左右,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01);而pMIR-TMEM33-mu+miR-146a組熒光強(qiáng)度無明顯差異(P>0.01);
  2. HE染色顯示正常對照組小鼠肺組織無明顯異常,煙霧致傷組小鼠肺部出現(xiàn)中重度的炎細(xì)胞浸潤及出血等;TaqMan RT-qPCR結(jié)果顯示,相對于miR-control組miR-146a的表達(dá)量(0.829±0.060),mi

6、R-146a組的表達(dá)量(11.640±0.190)上調(diào)了約10倍(P<0.01);RT-qPCR結(jié)果顯示,miR-146a組TNF-α和IL-1mRNA的表達(dá)顯著低于生理鹽水組和miR-control組(P<0.01);而TMEM33的表達(dá)與生理鹽水組及miR-control組相比無顯著性差異(P>0.05);Western Blot結(jié)果顯示,與生理鹽水組和miR-control組相比,miR-146a組COX-2及TMEM33表達(dá)相對

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