miR-146a在自身免疫性淋巴增生綜合征致病機(jī)制中的作用.pdf

1、microRNA是一類長度在22nt左右的非編碼調(diào)控RNA，它們通過與靶基因mRNA的3'UTRs不同程度的互補(bǔ)結(jié)合，以降解mRNA和抑制翻譯兩種方式調(diào)節(jié)生物體內(nèi)的基因表達(dá)，發(fā)揮轉(zhuǎn)錄后抑制的功能。生物信息學(xué)預(yù)測哺乳動物的microRNA能夠調(diào)節(jié)高達(dá)30％的編碼蛋白的基因，越來越多的證據(jù)表明microRNA在多種病理、生理條件下發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)功能。在眾多microRNA中，miR-146a最早被證實為參與天然免疫的調(diào)控因子，在免疫反應(yīng)和

2、炎癥性疾病中發(fā)揮重要作用。當(dāng)LPS刺激和病毒感染時，miR-146a在多種細(xì)胞中發(fā)揮負(fù)反饋調(diào)節(jié)因子作用，在單核細(xì)胞、肺泡上皮細(xì)胞、神經(jīng)小膠質(zhì)細(xì)胞中通過作用其靶基因IRAK1/2和TRAF6，抑制Toll樣受體信號通路活性，發(fā)揮炎癥抑制因子的作用。在骨髓過繼傳輸重建免疫系統(tǒng)的小鼠體系中，miR-146a被報道通過下調(diào)靶基因FADD的表達(dá)，抑制T細(xì)胞凋亡和IL-2表達(dá)，參與白血病發(fā)病。而在miR-146a基因敲出小鼠中，由于miR-146a

3、的缺失導(dǎo)致調(diào)節(jié)性T細(xì)胞部分抑制功能異常，使其喪失對于STAT信號通路的抑制作用，IFN-γ表達(dá)升高，引起T細(xì)胞活化，發(fā)生自身免疫性疾病，結(jié)果揭示了miR-146a在Treg細(xì)胞發(fā)揮外周免疫耐受中的重要調(diào)節(jié)作用。以上研究都證明miR-146a在慢性炎癥和獲得性免疫的過程中，仿佛一個強(qiáng)大的“剎車片”，發(fā)揮著負(fù)反饋抑制的功能。
　　microRNA表達(dá)譜研究表明，當(dāng)生理或病理的免疫反應(yīng)過程中，miR-146a的表達(dá)水平有顯著變化。對比天

4、然B細(xì)胞或天然T細(xì)胞，miR-146a在終末分化的淋巴細(xì)胞亞群Tfh、Treg和GCB細(xì)胞之中顯著升高。另外我們在之前的臨床研究工作中發(fā)現(xiàn)，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎滑膜組織中的CD4+T細(xì)胞的miR-146a表達(dá)顯著高于健康對照，并且高表達(dá)的miR-146a水平與TNF-α的水平呈正相關(guān)。據(jù)文獻(xiàn)報道，在癌癥、Sj(o)gren綜合征和硬皮病等自身免疫性疾病中，miR-146a同樣呈現(xiàn)高表達(dá)。這些疾病之中miR-146a都處于高標(biāo)達(dá)狀態(tài)，而miR-

5、146a在天然免疫之中發(fā)揮負(fù)反饋的機(jī)制顯然無法準(zhǔn)確解釋疾病慢性化和病理反應(yīng)持續(xù)存在的這一現(xiàn)象。
　　為了在體研究miR-146a在慢性炎癥、自身免疫性疾病中發(fā)揮的準(zhǔn)確作用，我們構(gòu)建了高表達(dá)miR-146a的轉(zhuǎn)基因小鼠。我們采用注射高濃度慢病毒構(gòu)建了miR-146a轉(zhuǎn)基因小鼠，通過PCR擴(kuò)增轉(zhuǎn)基因小鼠基因組特有病毒載體片段，鑒定構(gòu)建成功的轉(zhuǎn)基因小鼠F0代的4個小鼠。并且利用轉(zhuǎn)基因小鼠中eGFP與miR-146a同時表達(dá)的這一特性，通

6、過流式細(xì)胞儀快速鑒定小鼠外周血中eGFP的表達(dá)，從而快速的篩選、鑒定轉(zhuǎn)基因小鼠。利用此方法，我們可以快速鑒定轉(zhuǎn)基因陽性小鼠，并回交9代以上建立了穩(wěn)定品系。應(yīng)用熒光定量PCR技術(shù)，我們分析了轉(zhuǎn)基因小鼠的心、肝、脾、肺、腎、淋巴結(jié)等組織的miR-146a表達(dá)。定量PCR結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)基因小鼠的miR-146a的表達(dá)水平高于野生型對照3-8倍，而這樣的表述水平與自身免疫性疾病中miR-146a表達(dá)水平近似，同時我們也排除了miR-146a*對轉(zhuǎn)

7、基因小鼠功能及表型影響的可能性。
　　miR-146a轉(zhuǎn)基因小鼠成功構(gòu)建后，我們分析了其病理及免疫相關(guān)的表型。3周齡起，miR-146a轉(zhuǎn)基因小鼠出現(xiàn)脾臟和淋巴結(jié)腫大，在第4周差異最大達(dá)到8倍，而6周齡后保持在4倍左右。病理組織學(xué)的分析顯示早在8周齡，轉(zhuǎn)基因小鼠出現(xiàn)肺和肝臟的炎癥浸潤。先前有報道提示miR-146a可能參與血小板的形成，所以我們對轉(zhuǎn)基因小鼠進(jìn)行全血血象分析，但是除了單個核細(xì)胞數(shù)量略高外，其它所有分析項目均與野生型小

8、鼠沒有顯著區(qū)別。
　　接下來我們進(jìn)行了淋巴細(xì)胞各個亞群的分析。在T淋巴細(xì)胞亞群中，首先發(fā)現(xiàn)Treg細(xì)胞頻率略下降，但是T細(xì)胞(CD4+T和CD8+T)表面活化標(biāo)志分析中（包括CD25，CD69，CD44和CD62L），并未發(fā)現(xiàn)T細(xì)胞活化。而其它T細(xì)胞亞群的表達(dá)頻率與野生型對照無顯著差異，胸腺內(nèi)T細(xì)胞發(fā)育也正常。說明Treg細(xì)胞的頻率降低，還不足以誘導(dǎo)T細(xì)胞活化。另外一個T淋巴細(xì)胞的重要發(fā)現(xiàn)是，轉(zhuǎn)基因小鼠脾臟中發(fā)現(xiàn)顯著升高的雙陰性T

9、細(xì)胞(CD3+CD4-CD8-TCRβ+，doublenegativeT，DNT)，并且這一現(xiàn)象在8-52周齡小鼠中均有發(fā)現(xiàn)。
　　miR-146a轉(zhuǎn)基因小鼠中發(fā)現(xiàn):DNT細(xì)胞增加，淋巴結(jié)、脾臟腫大，肝、肺炎性浸潤，而且這些病理表象皆在低齡小鼠中發(fā)現(xiàn)，這一系列的病理表象與人類自身免疫性淋巴增生綜合征(autoimmunelymphoproliferativesymdrome，ALPS)十分相像。按照ALPS的臨床表現(xiàn)之一IL-10

10、等細(xì)胞因子、血清免疫球蛋白也會相應(yīng)增高。所以我們使用MILLIPLEX方法測定轉(zhuǎn)基因小鼠血清中32種細(xì)胞因子和趨化因子表達(dá)。結(jié)果顯示8周齡轉(zhuǎn)基因小鼠中血清中免疫球蛋白IgG1，IgG2a，IgG2b和IgG3顯著高于同年齡野生型小鼠，但是當(dāng)小鼠年齡到達(dá)52周齡時，雖然IgG1和IgG2a仍高于野生型對照，但I(xiàn)gG2b，IgG3已經(jīng)恢復(fù)。而血清中32種細(xì)胞因子和趨化因子，血清IgM和IgA在轉(zhuǎn)基因和野生型8-52周齡小鼠之間并無顯著差異。

11、
　　與血清IgG升高水平一致，B淋巴細(xì)胞(B220+)數(shù)量顯著增高，但表達(dá)頻率并無顯著變化，同時我們檢測B淋巴細(xì)胞其它亞群也無顯著區(qū)別，包括成熟B細(xì)胞(B220+AA4.1)、未成熟的B細(xì)胞（B220+AA4.1+）、新形成的或活化的B細(xì)胞(B220+IgM+CD21lowCD23low)、濾泡B細(xì)胞(B220+IgM+CD21intCD23high)，骨髓中B細(xì)胞發(fā)育也正常。然而，當(dāng)我們將增大的淋巴結(jié)進(jìn)行常規(guī)病理發(fā)現(xiàn)在淋巴結(jié)中

12、有許多疑似生發(fā)中心的結(jié)構(gòu)，進(jìn)一步的免疫組織化（PNA染色）證實最早在8周齡轉(zhuǎn)基因小鼠中檢測到大量自發(fā)生發(fā)中心結(jié)構(gòu)，同時免疫熒光共聚焦分析也得到了一致的結(jié)果。這一現(xiàn)象提示我們馬上檢測與之生發(fā)中心形成相關(guān)的Tfh和GCB細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因和野生型小鼠之間Tfh細(xì)胞比例沒有顯著的差異;而在8-52周齡的轉(zhuǎn)基因小鼠中的淋巴結(jié)、腸系膜淋巴結(jié)、PP體、脾臟等外周淋巴器官中，都發(fā)現(xiàn)GCB細(xì)胞的比例顯著升高。
　　綜上所述，在miR-146a轉(zhuǎn)

13、基因小鼠中發(fā)現(xiàn)脾臟和淋巴結(jié)腫大，肝臟、肺部炎癥浸潤，DNT細(xì)胞累積，血清IgG升高，GCB細(xì)胞增多，并且這些病理表型發(fā)病較早，隨年齡增長有一定的緩解。綜上所述轉(zhuǎn)基因小鼠的這些病理表征與人類自免性淋巴增生綜合征的臨床表現(xiàn)一致，說明我們構(gòu)建的miR-146a轉(zhuǎn)基因小鼠自發(fā)形成ALPS。
　　自免性淋巴增生綜合征的主要致病因素就是Fas基因突變和蛋白表達(dá)不足，F(xiàn)as介導(dǎo)的凋亡通路異常。為此，我們分析了野生小鼠及miR-146a轉(zhuǎn)基因小鼠

14、多個淋巴細(xì)胞亞群中Fas的表達(dá)。在生理條件下，野生型小鼠體內(nèi)Fas只在GCB細(xì)胞之中高表達(dá)，而上調(diào)miR-146a只在GCB細(xì)胞內(nèi)顯著下調(diào)了Fas的蛋白表達(dá)，對其它細(xì)胞亞群中的Fas表達(dá)并無影響。生物信息學(xué)分析顯示，在人、大鼠和小鼠3個種屬內(nèi)，miR-146a的種子區(qū)與Fas的3'UTR大體互補(bǔ)，提示Fas是miR-146a的潛在靶基因。我們使用熒光素酶報告基因法分析miR-146a的靶基因，共轉(zhuǎn)染編碼miR-146a和Fas的3'UT

15、R區(qū)域的質(zhì)粒于293FT細(xì)胞中，分析結(jié)果證實Fas是miR-146a的直接靶基因。為了進(jìn)一步證明了miR-146a靶向Fas基因下調(diào)其表達(dá)是特異性發(fā)生在生發(fā)中心形成過程中，而不是源于B細(xì)胞發(fā)育過程中的影響。我們分離miR-146轉(zhuǎn)基因或野生型小鼠的non-GCB細(xì)胞，分別混合野生型型CD4+T細(xì)胞，然后過繼轉(zhuǎn)移到SCID小鼠，7天后檢測來源于供體小鼠non-GCB細(xì)胞所形成GCB細(xì)胞的百分比及新生成GCB細(xì)胞之中Fas的表達(dá)。結(jié)果顯示來

16、源于轉(zhuǎn)基因小鼠的新形成的GCB細(xì)胞比例(27-42％)顯著高于來源于野生型的的GCB細(xì)胞比例(4-16％)。而相應(yīng)的來源于轉(zhuǎn)基因小鼠的GCB細(xì)胞中Fas表達(dá)顯著低于野生型來源。以上結(jié)果說明，F(xiàn)as是miR-146a在GCB細(xì)胞中的靶基因，而且其抑制作用特異性發(fā)生在生發(fā)中心形成過程中。
　　為了進(jìn)一步闡明miR-146a的介導(dǎo)B細(xì)胞功能障礙的機(jī)制，我們分離野生型和轉(zhuǎn)基因小鼠的天然B細(xì)胞，應(yīng)用cDNA表達(dá)譜芯片研究miR-146a在B

17、細(xì)胞中的靶基因，將基因芯片得到的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行Sylamer分析，進(jìn)而分析相關(guān)信號通路。將miR-146a的種子區(qū)的兩個結(jié)構(gòu)域與mRNA表達(dá)下調(diào)基因的3'端非編碼區(qū)進(jìn)行富集比對，發(fā)現(xiàn)這些能與miR-146a種子區(qū)互補(bǔ)配對的基因主要集中在轉(zhuǎn)基因B細(xì)胞中。將得到的差異基因進(jìn)行信號通路分析，發(fā)現(xiàn)主要集中在NF-κB，AP-1，IRF和STAT幾個信號通路中，先前已經(jīng)被確認(rèn)的TRAF6，IRAK1和CXCR4在我們的實驗中再次得到驗證。而這些結(jié)果

18、與我們體外B細(xì)胞增殖實驗一致，即在LPS刺激下，miR-146a高表達(dá)抑制了B細(xì)胞增殖。說明miR-146a通過抑制NF-κB信號通路，發(fā)揮負(fù)反饋調(diào)節(jié)作用同樣適用于B細(xì)胞。
　　轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)大量增殖的天然B細(xì)胞可以用淋巴細(xì)胞穩(wěn)態(tài)增殖的機(jī)制來解釋。為了驗證這一假設(shè)，我們分離轉(zhuǎn)基因和野生型小鼠的天然B細(xì)胞或CD4+T細(xì)胞，將其過繼傳輸?shù)矫庖呷毕莸腟CID受體小鼠體內(nèi)，用EdU摻入法檢測淋巴細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)增殖情況。在過繼傳輸?shù)?天后，我們

19、發(fā)現(xiàn)來源于轉(zhuǎn)基因小鼠的天然B細(xì)胞增殖情況顯著高于來源于野生小鼠的B天然細(xì)胞，但是CD4+T細(xì)胞二者之間沒有顯著差異，同時我們還發(fā)現(xiàn)高表達(dá)miR-146a的B細(xì)胞可以促進(jìn)T細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)增殖。結(jié)果揭示B細(xì)胞中持續(xù)表達(dá)的miR-146a促進(jìn)B細(xì)胞和T細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)增殖，這些發(fā)現(xiàn)為ALPS發(fā)病機(jī)制提供了一種新解釋。
　　大多數(shù)的ALPS患者表現(xiàn)為在幼年即出現(xiàn)非惡性淋巴結(jié)腫大及脾腫大，顯著增加雙陰性性T細(xì)胞，和較高的血清IgG水平。所有病理表型在

20、年幼時病情嚴(yán)重，而隨著年齡增長病情在一定程度上得以緩解。miR-146a轉(zhuǎn)基因小鼠三周齡即出現(xiàn)脾臟和淋巴結(jié)腫大，生后的第四周達(dá)到頂峰。所有年輕的轉(zhuǎn)基因小鼠的脾臟中都觀察到雙陰性T細(xì)胞增高。8周齡轉(zhuǎn)基因小鼠血清IgG1，IgG2b，IgG2a和IgG3的濃度高出野生型對照3-6倍，而52周齡時已經(jīng)有部分緩解。臨床上4-5％的ALPS患者存在肺部浸潤性病變和肝功能障礙，而miR-146轉(zhuǎn)基因小鼠肺和肝臟炎癥細(xì)胞浸潤發(fā)病率極高。另外，ALPS

21、患者易患霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤，而我們的轉(zhuǎn)基因小鼠老年腫瘤發(fā)病率達(dá)到20％以上（結(jié)果未出示）。不過，miR-146轉(zhuǎn)基因小鼠與ALPS患者診斷標(biāo)準(zhǔn)之間也有很大區(qū)別，25％的ALPS患者體內(nèi)可檢測到自身抗體，miR-146轉(zhuǎn)基因小鼠血清檢測不到自身抗體。此外，IL-10顯著增加也是ALPS患者的典型臨床表現(xiàn)，而我們分析了血清中32種細(xì)胞因子和趨化因子都沒有顯著的改變。這些數(shù)據(jù)說明，單獨改變一個microRNA(miR-146a)的表

22、達(dá)，并沒有打破小鼠體內(nèi)的免疫耐受狀態(tài)，而主要是促進(jìn)了淋巴細(xì)胞穩(wěn)態(tài)增殖，而ALPS的發(fā)病還需要諸如Fas等基因突變的累積，典型ALPS患者遺傳缺陷主要發(fā)生在凋亡通路，會直接打破淋巴細(xì)胞穩(wěn)態(tài)和免疫耐受。有報道顯示Fas基因突變和蛋白表達(dá)不足是ALPS發(fā)病的主要原因。本研究中，我們證實了高表達(dá)miR-146a下調(diào)了GCB細(xì)胞內(nèi)的Fas表達(dá)，最終導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因小鼠形成ALPS病理表癥。
　　在我們轉(zhuǎn)基因小鼠研究模型中，ALPS的致病因子似乎是

23、高表達(dá)的miR-146a的天然B細(xì)胞。而且天然B細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)增殖可以促進(jìn)T細(xì)胞的增殖，天然B細(xì)胞表面Fas表達(dá)下降，使得其更易于轉(zhuǎn)化為GCB細(xì)胞。這些發(fā)現(xiàn)結(jié)合先前的研究揭示，在GCB細(xì)胞內(nèi)特異地下調(diào)Fas表達(dá)，會使淋巴細(xì)胞穩(wěn)態(tài)失衡而導(dǎo)致淋巴細(xì)胞過度增生。我們推測GCB細(xì)胞內(nèi)下調(diào)Fas表達(dá)，還可促進(jìn)成熟T細(xì)胞的存活，使得活化T細(xì)胞易于丟失CD4或CD8的共受體，因此導(dǎo)致DNT細(xì)胞累積。有研究表明慢性活化性EB病毒感染患者呈現(xiàn)出ALPS患者的