骨髓間充質干細胞NMⅡ基因調控對吸入性損傷療效及機制研究.pdf

1、吸入性損傷在人類城市發(fā)展史中曾造成巨大的災難，1942年美國波士頓椰樹林夜總會火災，密閉空間起火后患者吸入大量未燃燼的煙霧、炭粒、有刺激性的化學物質等，雖經(jīng)搶救，但是大量死亡，共造成造成492人死亡，成為美國傷亡最為慘重的火災事故，主要就是吸入性損傷所致。上海2010年11月15日，靜安區(qū)膠州路重大火災，上海市醫(yī)療機構共救治傷員127人，其中死亡41人，收治住院治療71人，死亡和住院的大部分人都有吸入性損傷，其發(fā)病率和病死率非常高。

2、r>　　骨髓間充質干細胞(BMSC)是一類具備自我更新和分化潛能的多能干細胞，取材簡便，不會發(fā)生免疫排斥反應，具有重要的免疫調節(jié)和抗炎活性，研究發(fā)現(xiàn)其能夠向多種組織誘導分化，如骨、軟骨等，同時具備較強的內(nèi)分泌能力和免疫調節(jié)功能，是理想的組織修復來源，近年研究證實，BMSC移植能改善急性肺損傷(ALI)肺內(nèi)及全身的炎癥反應，調節(jié)AL2體內(nèi)免疫紊亂，“歸巢”至肺損傷區(qū)域，向肺內(nèi)功能細胞分化并發(fā)揮相應功能，參與受損肺組織的修復，因而被認為是急

3、性肺損傷治療中極具前景的治療措施。
　　雖然BMSC移植治療AL2有很好的效果，但是在體內(nèi)的移植率和存活率受多因素影響，壞死或凋亡是最主要形式，因此，提高或者改善BMSC移植后在體內(nèi)的移植率和存活率是這種治療方法得到廣泛應用的關鍵所在，越來越多的研究者提出了多種學說，探索了多種方法以期能夠提高移植BMSC的移植率和存活率。
　　肌球蛋白是一種球蛋白，是肌肉的主要組成分子，主要為肌肉收縮提供力，它具有酶的活性，可以通過與肌動蛋

4、白相互作用，水解ATP的末端磷酸基團和GTP、CTP等，將化學能轉化為機械能。肌球蛋白也廣泛存在于非肌肉組織中稱為非肌肉球蛋白，非肌肉肌球蛋白Ⅱ(non-muscle myosinⅡ，NMⅡ)是非肌球蛋白家族中的一種，文獻報道它是多種疾病的關鍵分子，參與了細胞的各種生理活動，特別是信號轉導方面，它是細胞正常生理活動的一種關鍵蛋白分子，具有很重要信號轉導和調節(jié)作用，因此具有很高的研究價值。
　　鑒于此，我們選取NMⅡ為研究對象，并經(jīng)

5、過前期研究發(fā)現(xiàn)，下調骨髓間充質干細胞中非肌肉球蛋白NMⅡ，再移植到煙霧急性肺損傷的模型上，通過比較發(fā)現(xiàn)其效果比單純無修飾的骨髓間充質干細胞移植效果更好。通過進一步研究發(fā)現(xiàn)，調控NMⅡ基因可以使骨髓間充質干細胞在移植凋亡、減輕炎癥反應等方面比未調控NMⅡ基因的骨髓間充質干細胞更為明顯。通過一系列實驗后我們發(fā)現(xiàn)，下調NMⅡ基因表達能夠抑制干細胞凋亡，促進骨髓間充質干細胞歸巢至損傷部位，降低損傷部位炎癥反應，比傳統(tǒng)的單純使用間充質干細胞更為有

6、效，尤其對毛細血管豐富的肺部損傷更加有效。
　　對NMⅡ基因進一步深入研究，可以為干細胞治療煙霧吸入性損傷以及ALI/ARDS引入新的研究靶點并向臨床應用轉化。
　　第一部分 骨髓間充質干細胞的制備及鑒定
　　目的:根據(jù)課題研究的目的，制備骨髓間充質干細胞并進行鑒定，為后續(xù)研究NMⅡ基因調控治療吸入性損傷模型的療效和保護機制提供載體。
　　方法:大鼠骨髓間充質干細胞的分離和培養(yǎng)過程如下:選取周齡4周，體重160g

7、-200g左右的雄性大鼠，分離大鼠的股骨和脛骨獲取骨髓，200目濾網(wǎng)過濾至細胞培養(yǎng)皿中，在37℃溫度下5％CO2培養(yǎng)箱中進行貼壁培養(yǎng)，細胞培養(yǎng)2-3代后進行形態(tài)學鑒定、表面抗原鑒定、分化潛能的鑒定。
　　結果:顯微鏡下觀察到貼壁細胞的形態(tài)大小不一，形態(tài)各樣，大部分成梭形生長，形態(tài)類似成纖維細胞;流式細胞儀檢測細胞表型鑒定為符合骨髓間充質干細胞的表面抗原;細胞經(jīng)過成脂成骨誘導后為陽性。
　　結論:經(jīng)過鑒定，所獲取的細胞為骨髓間

8、充質干細胞。
　　第二部分 干擾NMⅡ表達的載體構建和細胞株的篩選
　　目的:制備NMⅡ表達降低的細胞株，為后續(xù)治療提供細胞。
　　方法:通過干擾序列的設計和重組載體的構建，轉染前面已鑒定的骨髓間充質干細胞中，然后進行鑒定。
　　結果:得到重組后的PLL載體，轉染至骨髓間充質干細胞中，得到了NMⅡ表達降低的骨髓間充質干細胞
　　結論:經(jīng)過鑒定，轉染重組載體的骨髓間充質干細胞NMⅡ表達降低。
　　第三部

9、分 骨髓間充質干細胞NMⅡ基因調控對吸入性損傷療效及機制研究
　　目的:檢測NMⅡ基因調控的骨髓間充干細胞對吸入性損傷模型的治療效果并探討其機制
　　方法:首先建立煙霧吸入性肺損傷模型;實驗動物進行分組為對照組，損傷組，BMSC治療組，BMSC-ShRNA治療組四組;分別采集大鼠動脈血進行血氣分析;使用探針CM-DiI標記的骨髓間充質干細胞技術檢測細胞在大鼠體內(nèi)的分布情況;大鼠支氣管肺泡灌洗液的收集;大鼠肺臟的干濕比測定;H

10、E檢測24h肺部的炎癥反應情況;ELISA檢測支氣管肺泡灌洗液(BALF)中TNF-α和IL-10因子;NMⅡ基因沉默對BMSC細胞凋亡的影響;NMⅡ基因沉默對BMSC細胞旁分泌系統(tǒng)的影響。
　　結果:干細胞移植后的24h時間點取血進行血氣分析發(fā)現(xiàn)，損傷組大鼠出現(xiàn)明顯的低氧血癥、二氧化碳潴留和酸中毒癥狀;而治療組與損傷組比較差異具有顯著性，可推斷BMSCs移植后對肺損傷有治療作用。使用CD-DiI標記的轉染NMⅡ-ShRNA的骨髓

11、間充質干細胞，尾靜脈注射吸入性損傷模型，1、4、7天取大鼠肺臟，染色，熒光顯微鏡下觀察到BMSCs細胞的歸巢。HE染色發(fā)現(xiàn)干擾組的損傷情況明顯減輕。肺泡灌洗液(BALF) ElISA法檢測肺泡灌洗液中TNF-a降低和IL-10的濃度升高。細胞實驗中的干擾組比為干擾組的caspase-3表達明顯降低。NMⅡ基因沉默對BMSC細胞旁分泌系統(tǒng)HGF的VEGF都比正常組升高。
　　結論:下調NMⅡ基因表達能夠抑制干細胞凋亡，促進骨髓間充質