Kupffer細(xì)胞中microRNA-155的缺失減輕小鼠肝臟部分熱缺血再灌注損傷.pdf

1、第一部分小鼠肝臟部分熱缺血再灌注損傷對(duì)肝臟miR-155表達(dá)的影響
　　目的：探討小鼠肝臟部分熱缺血再灌注損傷對(duì)缺血肝組織miR-155表達(dá)的影響。
　　方法：取野生型 C57BL/6（WT）小鼠，將其隨機(jī)分為兩組：假手術(shù)組及手術(shù)組，每組20只，建立肝臟部分熱缺血再灌注損傷模型。假手術(shù)組（sham），不阻斷肝臟左葉、中葉血流，其余所有操作同手術(shù)組；手術(shù)組(I/R)，阻斷肝臟左葉、中葉血流1小時(shí)后，松開(kāi)血管夾，開(kāi)放血流，進(jìn)行再

2、灌注。缺血1小時(shí)再灌注6小時(shí)后，評(píng)估小鼠存活率，并采集全血血漿檢測(cè)谷丙轉(zhuǎn)氨酶（alanine aminotransferase, ALT）及谷草轉(zhuǎn)氨酶（aspertate aminotransferase, AST）水平以評(píng)估肝功能和缺血肝臟標(biāo)本行HE染色，評(píng)價(jià)肝臟損傷程度，并且根據(jù)Suzuki’s標(biāo)準(zhǔn)，將肝臟損傷情況半定量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。通過(guò)TaqMan探針對(duì)肝組織進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative real-t

3、ime polymerase chain reaction，qRT-PCR）檢測(cè)缺血再灌注損傷對(duì)miR-155表達(dá)的影響。結(jié)果：小鼠缺血1小時(shí)再灌注6小時(shí)后，兩組小鼠存活率均達(dá)95％以上，可以達(dá)到實(shí)驗(yàn)要求。小鼠肝臟經(jīng)歷部分熱缺血再灌注損傷后，出現(xiàn)明顯的肝功能損害，手術(shù)組ALT和AST比假手術(shù)組明顯升高（P<0.0001）。肝臟損傷病理顯示：假手術(shù)組，小鼠肝組織結(jié)構(gòu)基本正常，小葉中央靜脈，肝細(xì)胞索結(jié)構(gòu)清晰，肝臟無(wú)淤血，細(xì)胞無(wú)變性壞死，肝竇

4、排列整齊，未見(jiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。手術(shù)組小鼠肝臟經(jīng)歷1小時(shí)缺血6小時(shí)再灌注后，可見(jiàn)肝臟明顯淤血，肝細(xì)胞索紊亂排列，不同程度的水腫變性和空泡狀變，可見(jiàn)大量片狀壞死灶，伴有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。與假手術(shù)組相比，手術(shù)組Suzuki’s評(píng)分顯著增高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.0001）。與假手術(shù)組相比較，手術(shù)組小鼠肝臟缺血再灌注后損傷肝臟組織中miR-155的表達(dá)明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。
　　結(jié)論：我們成功建立了小鼠部分熱缺血再

5、灌注損傷模型，缺血再灌注損傷增加肝臟miR-155的表達(dá)。
　　第二部分 miR-155缺失減輕小鼠肝臟部分熱缺血再灌注損傷與Kupffer細(xì)胞有關(guān)
　　目的：探討miR-155缺失是否通過(guò)調(diào)節(jié)Kupffer細(xì)胞進(jìn)一步減輕小鼠肝臟部分熱缺血再灌注損傷。
　　方法：采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction, PCR）行microRNA-155基因敲除（miR-155-/-）小鼠鑒定。將小鼠分

6、為四組:（1）WT小鼠對(duì)照組：WT小鼠于手術(shù)前24小時(shí)尾靜脈注射與實(shí)驗(yàn)組小鼠等量的磷酸鹽緩沖液，（2）miR-155-/-小鼠對(duì)照組：miR-155-/-小鼠于手術(shù)前24小時(shí)尾靜脈注射與實(shí)驗(yàn)組小鼠等量的磷酸鹽緩沖液，（3）WT小鼠實(shí)驗(yàn)組：WT小鼠于手術(shù)前24小時(shí)尾靜脈注射GdCl3溶液（10 mg/kg），（4）miR-155-/-小鼠實(shí)驗(yàn)組：miR-155-/-小鼠于手術(shù)前24小時(shí)尾靜脈注射 GdCl3溶液（10 mg/kg）。對(duì)各組

7、小鼠進(jìn)行肝臟部分熱缺血再灌注損傷手術(shù)，缺血1小時(shí)再灌注6小時(shí)后，采集全血血漿檢測(cè)ALT及AST水平以評(píng)估肝功能，將缺血肝臟標(biāo)本行HE染色，評(píng)價(jià)肝臟損傷程度，并且根據(jù)Suzuki’s標(biāo)準(zhǔn)，將肝臟損傷情況半定量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
　　結(jié)果：WT小鼠陽(yáng)性條帶為465bp，miR-155-/-小鼠陽(yáng)性條帶為600bp。經(jīng)尾靜脈注射GdCl3溶液的WT小鼠和miR-155-/-小鼠，ALT和AST水平顯著低于相應(yīng)對(duì)照組小鼠轉(zhuǎn)氨酶水平，差異具有

8、統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.0001）。并且，注射 GdCl3溶液的WT小鼠和miR-155-/-小鼠的轉(zhuǎn)氨酶水平?jīng)]有明顯差異，差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。而注射磷酸鹽緩沖液的WT小鼠，ALT和AST水平顯著高于注射磷酸鹽緩沖液的miR-155-/-小鼠的轉(zhuǎn)氨酶。兩實(shí)驗(yàn)組肝臟病理學(xué)切片與相應(yīng)的對(duì)照組相比，組織損傷明顯減弱。WT小鼠對(duì)照組術(shù)前24小時(shí)腹腔注射磷酸鹽緩沖液，肝臟經(jīng)歷缺血再灌注后，可見(jiàn)肝臟明顯淤血，肝細(xì)胞索紊亂排列，不同程度的

9、水腫變性和空泡狀變，可見(jiàn)片狀壞死，伴有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。miR-155-/-小鼠對(duì)照組，肝臟損傷較 WT小鼠對(duì)照組顯著減弱，Suzuki’s評(píng)分顯著降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。實(shí)驗(yàn)組，WT小鼠和miR-155-/-小鼠肝組織結(jié)構(gòu)破壞減少，可見(jiàn)少許灶狀壞死及點(diǎn)狀細(xì)胞變性壞死，大部分的小葉中央靜脈及肝細(xì)胞索結(jié)構(gòu)尚清晰，肝臟淤血減弱，肝竇排列整齊，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)明顯減少。
　　結(jié)論：miR-155缺失通過(guò)作用于 Kupffer細(xì)

10、胞，進(jìn)一步減輕肝臟部分熱缺血再灌注損傷。
　　第三部分miR-155缺失通過(guò)調(diào)節(jié)Kupffer細(xì)胞極化減輕小鼠肝臟部分熱缺血再灌注損傷
　　目的：探討miR-155缺失減輕小鼠肝臟部分熱缺血再灌注損傷與其調(diào)節(jié)Kupffer細(xì)胞極化的關(guān)系。
　　方法：對(duì)WT小鼠及miR-155-/-小鼠做肝臟部分熱缺血再灌注損傷，缺血1小時(shí)再灌注6小時(shí)后,采集全血血漿檢測(cè)ALT及AST水平以評(píng)估肝功能,將缺血肝臟標(biāo)本行HE染色，評(píng)價(jià)肝臟

11、損傷程度，并且根據(jù)Suzuki’s標(biāo)準(zhǔn)，將肝臟損傷情況半定量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。用TUNEL技術(shù)，檢測(cè)組織中肝細(xì)胞凋亡的情況。qRT-PCR檢測(cè)肝組織中炎性因子mRNA表達(dá)水平。密度梯度離心法分離小鼠肝臟中Kupffer細(xì)胞，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)肝臟缺血再灌注損傷后 Kupffer細(xì)胞的表型及分型差異。提取 WT小鼠及miR-155-/-小鼠腹腔巨噬細(xì)胞，并貼壁純化，將細(xì)胞分4組：A組：WT小鼠腹腔巨噬細(xì)胞未刺激組，B組：miR-155-/-小鼠

12、腹腔巨噬細(xì)胞未刺激組，C組：WT小鼠腹腔巨噬細(xì)胞+ LPS（50ng/ml）刺激24小時(shí)，D組：miR-155-/-小鼠腹腔巨噬細(xì)胞+ LPS（50ng/ml）刺激24小時(shí)。收集每組細(xì)胞，流式檢測(cè)腹腔巨噬細(xì)胞表型及分型的差異；ELISA檢測(cè)腹腔巨噬細(xì)胞培養(yǎng)液中TNF-α和IL-10濃度。Transwell共培養(yǎng)研究 Kupffer細(xì)胞和巨噬細(xì)胞對(duì)肝細(xì)胞凋亡的影響。
　　結(jié)果：miR-155-/-小鼠組ALT和AST水平明顯低于WT

13、小鼠組。肝臟組織病理學(xué)切片顯示：與WT小鼠組相比，miR-155-/-小鼠組肝臟組織壞死區(qū)域明顯減小，淤血也較少，肝組織結(jié)構(gòu)破壞明顯減弱。WT小鼠組肝組織淤血明顯增強(qiáng)，肝細(xì)胞索嚴(yán)重破壞，可見(jiàn)多個(gè)片狀壞死區(qū)域。與WT小鼠組相比，miR-155-/-小鼠組Suzuki’s評(píng)分顯著降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001），并且凋亡的肝臟細(xì)胞也顯著減少（P<0.05）。缺血再灌注損傷后，兩組小鼠肝臟中炎性因子的表達(dá)水平均明顯升高，miR-15

14、5-/-小鼠肝臟TNF-α的表達(dá)水平明顯低于WT小鼠，而miR-155-/-小鼠肝臟IL-10的表達(dá)水平明顯高于WT小鼠。肝臟缺血再灌注后，miR-155-/-小鼠組Kupffer細(xì)胞CD80、CD86和MHC-Ⅱ的表達(dá)水平明顯低于WT組小鼠，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。miR-155-/-小鼠組，M1型（CD11c+CD206-） Kupffer細(xì)胞較 WT組明顯減少，而 M2型（CD11c-CD206+）Kupffer較WT

15、組卻明顯增多，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。分離純化的腹腔巨噬細(xì)胞純度>90%，可以滿足實(shí)驗(yàn)需要。無(wú)LPS刺激組（PBS孵育組），miR-155-/-小鼠來(lái)源的腹腔巨噬細(xì)胞CD80、CD86和MHC-Ⅱ的表達(dá)明顯低于WT小鼠來(lái)源的巨噬細(xì)胞，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（CD80 P<0.01；CD86 P<0.05; MHC-ⅡP<0.05）。經(jīng)LPS刺激后，兩種小鼠來(lái)源的巨噬細(xì)胞CD80、CD86、CD40和MHC-Ⅱ的表達(dá)均明顯升高，但

16、是，miR-155-/-小鼠來(lái)源的腹腔巨噬細(xì)胞 CD80、CD86、CD40和MHC-Ⅱ的表達(dá)水平與WT小鼠組相比明顯降低，差異顯著（CD80 P<0.01；CD86 P<0.05; CD40 P<0.01；MHC-ⅡP<0.05）。無(wú)LPS刺激組，miR-155-/-小鼠來(lái)源的腹腔巨噬細(xì)胞M1型（CD11c+CD206-）細(xì)胞比例顯著低于WT小鼠組（P<0.01），而其M2型（CD11c-CD206+）細(xì)胞比例卻顯著高于WT小鼠組（P

17、<0.05）。經(jīng)LPS刺激后，兩種小鼠來(lái)源的巨噬細(xì)胞 M1型細(xì)胞比例均升高，M2型細(xì)胞比例均降低。但是，miR-155-/-小鼠組M1型細(xì)胞比例明顯低于WT小鼠組相比，M2型細(xì)胞比例明顯高于WT小鼠組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（M1 P<0.05，M2 P<0.01）。LPS刺激后，巨噬細(xì)胞培養(yǎng)上清中TNF-α和IL-10濃度均明顯升高，miR-155-/-小鼠組巨噬細(xì)胞培養(yǎng)上清中TNF-α的濃度明顯低于 WT小鼠組，而 miR-155-/-

18、小鼠組巨噬細(xì)胞培養(yǎng)上清中 IL-10的濃度明顯高于WT小鼠組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P值均小于0.05）。巨噬細(xì)胞和Kupffer細(xì)胞加速肝細(xì)胞凋亡；miR-155-/-小鼠來(lái)源的Kupffer細(xì)胞較 WT小鼠來(lái)源的Kupffer細(xì)胞對(duì)肝細(xì)胞促凋亡作用明顯減弱，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。
　　結(jié)論：miR-155缺失可以通過(guò)調(diào)節(jié)Kupffer細(xì)胞，抑制其向M1型分化，而促進(jìn)其向M2型分化，減少炎性因子TNF-α分泌，而促進(jìn)