RvE1對(duì)肝缺血再灌注損傷中Kupffer細(xì)胞活化調(diào)控作用的研究.pdf

1、背景：肝臟缺血再灌注損傷(hepatic ischemia-reperfusion injury,HIRI)在肝臟外科領(lǐng)域十分常見,處理嚴(yán)重的肝外傷、施行廣泛的肝葉切除、肝移植以及出血性休克、感染等均涉及到HIRI。它可導(dǎo)致術(shù)后肝損傷和肝功能衰竭甚至全身多臟器功能衰竭,是影響疾病預(yù)后主要因素之一。因此探討其發(fā)病機(jī)制具有非常重要的意義。其發(fā)生機(jī)理非常復(fù)雜,確切機(jī)制目前尚不完全清楚,目前的研究表明肝缺血再灌注損傷是涉及多種細(xì)胞、分子之間相互

2、作用的復(fù)雜的病理生理過(guò)程,其中Kupffer細(xì)胞作為體內(nèi)最多的定居巨噬細(xì)胞群發(fā)揮了關(guān)鍵的作用。肝臟發(fā)生缺血時(shí),由于無(wú)氧代謝造成的ATP生成減少,細(xì)胞內(nèi)乳酸堆積以及線粒體氧化磷酸化低下所致的酸性環(huán)境和細(xì)胞內(nèi)Ca2+增加而使Kupffer細(xì)胞處于“預(yù)”激活狀態(tài),當(dāng)血流重新開放后門靜脈中的內(nèi)毒素在數(shù)分鐘內(nèi)就可使處于“預(yù)”激活狀態(tài)的Kupffer細(xì)胞激活,活化的Kupffer細(xì)胞可以釋放大量氧自由基和多種活性因子,這些炎性因子以單個(gè)的形式,也可

3、以通過(guò)彼此間網(wǎng)絡(luò)狀協(xié)同作用,形成瀑布樣效應(yīng),加重了肝損傷。因此,探討Kupffer細(xì)胞在HIRI的病理生理過(guò)程的作用,才有可能更有效地防治HIRI。RvE1(Resolvin E1,RvE1)是不飽和脂肪酸EPA的一種代謝產(chǎn)物。近年研究表明RvE1具有抗炎和前消退炎癥的特性,它可以阻止炎癥細(xì)胞跨上皮和跨內(nèi)皮遷移;促進(jìn)巨噬細(xì)胞吞噬凋亡的中性粒細(xì)胞;下調(diào)樹突狀細(xì)胞白介素-12的分泌;上調(diào)T細(xì)胞CCR5的表達(dá);調(diào)節(jié)白細(xì)胞粘附分子的表達(dá),減少白

4、細(xì)胞滾動(dòng);選擇性的阻斷腺苷和血栓素受體激動(dòng)劑U46619誘導(dǎo)的血小板聚集。它對(duì)許多炎癥性疾病有良好的預(yù)防和治療效果,鑒于炎癥是HIRI的關(guān)鍵環(huán)節(jié)且RvE1對(duì)肝缺血再灌注損傷及Kupffer細(xì)胞的活化的調(diào)控作用目前國(guó)內(nèi)外尚未見報(bào)道。為此,我們建立大鼠肝缺血再灌注動(dòng)物模型,分離并原代培養(yǎng)大鼠Kupffer細(xì)胞,檢測(cè)Kupffer細(xì)胞中趨化因子Chemerin和MIP-2的表達(dá)及其分泌細(xì)胞因子TNF-α和IL-1β的變化,探討RvE1對(duì)肝缺血

5、再灌注損傷影響及對(duì)肝缺血再灌注損傷時(shí)Kupffer細(xì)胞活化的調(diào)控作用,擬對(duì)臨床中應(yīng)用RvE1防治肝臟缺血-再灌注損傷提供實(shí)驗(yàn)性理論依據(jù)。
　　目的：通過(guò)體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn),研究RvE1對(duì)大鼠肝缺血/再灌注損傷后Kupffer細(xì)胞中Chemerin和MIP-2基因的表達(dá)和其分泌TNF-α、IL-1β水平的變化的影響,探討其在肝缺血/再灌注損傷中的意義。
　　方法：(1)采用兩步消化、梯度離心、選擇性貼壁的方法提取大鼠Kupffer

6、細(xì)胞,并通過(guò)熒光顯微鏡觀察、臺(tái)盼藍(lán)染色、溶菌酶免疫組化染色、印度墨汁示蹤分離等方法進(jìn)行鑒定,以建立穩(wěn)定的分離、培養(yǎng)大鼠Kupffer細(xì)胞的技術(shù)路線。
　　(2)構(gòu)建大鼠肝熱缺血再灌注損傷模型,采用ELISA法檢測(cè)再灌注損傷后0、1、6、12、24小時(shí)大鼠Kupffer細(xì)胞原代培養(yǎng)上清液中TNF-α、IL-1β濃度的變化,并采用RT-PCR、免疫組化染色技術(shù)對(duì)Kupffer細(xì)胞中Chemerin和MIP-2的mRNA和蛋白的表達(dá)進(jìn)行

7、檢測(cè),研究其在肝缺血/再灌注損傷中的意義。
　　(3)72只雄性SD大鼠分為對(duì)照組、缺血再灌注損傷和RvE1治療組,觀察RvE1對(duì)大鼠肝缺血再灌注損傷1、6、12、和24小時(shí)后血清中ALT和AST變化及其對(duì)肝臟病理改變的影響,觀察RvE1對(duì)Kupffer細(xì)胞中Chemerin和MIP-2的mRNA和蛋白及其分泌TNF-α、IL-1β的變化,探討RvE1對(duì)肝缺血再灌注損傷的保護(hù)作用機(jī)制。
　　(4)通過(guò)體外實(shí)驗(yàn),觀察RvE1體

8、外對(duì)大鼠肝缺血再灌注損傷活化的Kupffer細(xì)胞中Chemerin和MIP-2的mRNA及其分泌TNF-α、IL-1β的影響,探討RvE1抑制Kupffer細(xì)胞活化的機(jī)理。
　　結(jié)果：(1).本實(shí)驗(yàn)所分離Kupffer細(xì)胞獲得率為7.34±1.54×106cells/鼠肝,純度為87.18±3.18％,活性為94.3％±2.6％,吞噬印度墨汁實(shí)驗(yàn)提示所分離的Kupffer細(xì)胞有很好的吞噬功能。所獲得的Kupffer細(xì)胞可以達(dá)到實(shí)驗(yàn)

9、要求。
　　(2)在再灌注損傷后的極早期,Kupffer細(xì)胞即分泌大量TNF-α和IL-1β,二者在再灌注1h后幾乎達(dá)到高峰,至實(shí)驗(yàn)觀察最后時(shí)間點(diǎn),再灌注24h時(shí),其分泌TNF-α和IL-1β的水平依然高于對(duì)照組。
　　(3) RvE1組血清中ALT和AST明顯低于缺血/再灌注組(P<0.05),Kupffer細(xì)胞培養(yǎng)上清液中TNF-α和IL-1β水平及Kupffer細(xì)胞中Chemerin和MIP-2蛋白和mRNA表達(dá)較假手

10、術(shù)組明顯升高(P<0.05),術(shù)前應(yīng)用RvE1可以明顯降低這些炎性因子的表達(dá)(P<0.05)。
　　(4)經(jīng)缺血后再灌注6小時(shí)活化的Kupffer細(xì)胞可分泌大量TNF-α和IL-1β,在Kupffer細(xì)胞的培養(yǎng)液中分別加入不同濃度的RvE1,KC分泌的TNF-α和IL-1β水平均有不同程度下降(P<0.05)。且隨著培養(yǎng)液中RvE1濃度的增加,抑制程度愈加明顯。缺血再灌注6小時(shí)活化的Kupffer細(xì)胞中Chemerin和MIP-2

11、 mRNA含量高于假手術(shù)組(P<0.05),在活化的Kupffer細(xì)胞的原代培養(yǎng)液中分別加入不同濃度的RvE1,KC中Chemerin和MIP-2 mRNA水平明顯下降(P<0.05),具有劑量依從關(guān)系,RvE1高劑量組的Chemerin和MIP-2 mRNA水平仍然高于假手術(shù)組(P<0.05),有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)論：(1)采用兩步消化、梯度離心、選擇性貼壁的提取方法所提取的Kupffer細(xì)胞可保持良好的生物學(xué)性狀,其數(shù)量、活

12、力和純度均能達(dá)到實(shí)驗(yàn)要求。
　　(2)大鼠部分肝熱缺血再灌注模型具有再灌注損傷病理過(guò)程典型的特點(diǎn),可較好的模擬臨床肝臟反應(yīng)肝缺血再灌注損傷的病理過(guò)程。肝缺血再灌注過(guò)程中Kupffer細(xì)胞分泌的大量TNF-α和IL-1β對(duì)HIRI的發(fā)生、發(fā)展起關(guān)鍵作用,而其產(chǎn)生的Chemerin和MIP-2也可能是介導(dǎo)HIRI發(fā)生的重要因素。
　　(3) RvE1預(yù)處理可降低HIRI大鼠血清中ALT和AST水平,且可部分抑制HIRI大鼠Kup

13、ffer細(xì)胞活化,抑制Kupffer細(xì)胞中TNF-α和IL-1β的分泌,并可下調(diào)Kupffer細(xì)胞中Chemerin和MIP-2的mRNA和蛋白的表達(dá)。RvE1對(duì)大鼠肝缺血再灌注損傷具有較好的治療作用。
　　(4) RvE1在體外可以減少肝臟缺血再灌注活化的Kupffer細(xì)胞分泌過(guò)度的TNF-α和IL-1β,并可降低Kupffer細(xì)胞中Chemerin和MIP-2 mRNA的表達(dá),其效應(yīng)具有劑量依從關(guān)系。提示RvE1在體外對(duì)肝臟缺