氫分子對大鼠肝缺血再灌注損傷保護(hù)作用的研究.pdf

1、研究背景和目的:
　　肝臟缺血再灌注(ischemia/reperfusion I/R)損傷是缺血的肝組織恢復(fù)血供后使肝臟缺血性損傷進(jìn)一步加重的現(xiàn)象，涉及自由基產(chǎn)生、中性粒細(xì)胞浸潤及炎性介質(zhì)大量釋放等一系列病理生理過程。由于肝臟外科手術(shù)經(jīng)常需要阻斷肝門，不可避免的會造成肝臟I/R，從而加重術(shù)后肝功能損傷甚至導(dǎo)致肝臟衰竭。許多研究表明氧化應(yīng)激在缺血再灌注肝損傷發(fā)生發(fā)展過程中有著重要的作用，抑制氧自由基的產(chǎn)生或通過生化反應(yīng)清除氧自由基

2、可以有效減輕肝損傷。
　　在生理情況下，生物體內(nèi)的自由基的產(chǎn)生與被清除，維持在一個穩(wěn)定水平上。如果自由基的產(chǎn)生與清除失衡，則會導(dǎo)致氧化應(yīng)激反應(yīng)。有研究發(fā)現(xiàn)氫氣有選擇性抗氧化作用，能夠有選擇性地清除亞硝酸陰離子和羥自由基。第二軍醫(yī)大學(xué)孫學(xué)軍教授課題組通過高壓將氫氣溶解于生理鹽水中成功制備了氫生理鹽水并申請了專利，這項技術(shù)可以使氫分子的研究更加標(biāo)準(zhǔn)化，介于缺血再灌注肝損傷機(jī)制和氫生理鹽水獨特的選擇性抗氧化性質(zhì)，本課題以大鼠肝缺血再灌注

3、損傷為模型，擬驗證氫生理鹽水對大鼠肝缺血再灌注損傷的保護(hù)作用，并初步探討其作用的機(jī)制。
　　研究方法
　　1.通過無創(chuàng)血管夾夾閉肝中葉和左葉的門靜脈和肝動脈，使約70％的肝臟缺血，90 min后去除血管夾，恢復(fù)肝血流180min建立大鼠肝缺血再灌注損傷模型，再灌注180min后收集血漿及肝臟標(biāo)本。
　　2.HE染色觀察肝臟形態(tài)學(xué)改變及炎癥細(xì)胞浸潤。
　　3.運用自動生化分析儀檢測肝功能。
　　4.比色法檢測

4、肝組織中MDA、SOD、GSH含量，觀察肝組織氧化反應(yīng)程度。
　　5.ELISA法檢測肝組織中TNF-α、IL-1β、IL-6、HMGB1活性觀察肝組織炎性反應(yīng)程度。
　　6.差速離心法分離肝細(xì)胞線粒體及胞漿。
　　7.透射電鏡觀察肝細(xì)胞線粒體改變。
　　8.比色法檢測線粒體中MDA、GSH、GSSG含量，觀察線粒體氧化反應(yīng)程度。
　　9.熒光分光光度計檢測線粒體ATP變化，Clark氧電極法檢測線粒體呼吸

5、功能，觀察線粒體損傷情況。
　　結(jié)果
　　（一）氫生理鹽水能使I/R誘導(dǎo)的肝損傷明顯減輕。
　　1.氫生理鹽水組谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)和谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)水平明顯低于生理鹽水對照組。
　　2.HE檢測顯示氫生理鹽水組損傷后肝臟形態(tài)結(jié)構(gòu)好于生理鹽水對照組，中性粒細(xì)胞浸潤少于生理鹽水對照組。
　?。ǘ渖睇}水能有效抑制缺血再灌注肝組織氧化應(yīng)激及炎性反應(yīng)
　　1.氫生理鹽水組肝組織MDA水平明顯低于生理

6、鹽水對照組，而SOD活力、GSH含量明顯高于生理鹽水對照組。
　　2.氫生理鹽水組肝組織中TNF-α、IL-1β、IL-6、HMGB1活性明顯低于生理鹽水對照組。
　?。ㄈ渖睇}水能明顯減輕I/R誘導(dǎo)的肝細(xì)胞線粒體損傷和氧化反應(yīng)
　　1.氫生理鹽水組線粒體中MDA、GSSG水平低于生理鹽水對照組，而GSH含量則高于生理鹽水對照組。
　　2.氫生理鹽水組線粒體ATP含量高于生理鹽水對照組，氫生理鹽水能顯著提高線

7、粒體呼吸控制率及磷氧比，改善線粒體呼吸功能。
　　結(jié)論
　　本課題以大鼠肝缺血再灌注損傷模型為研究對象，驗證氫生理鹽水對肝臟缺血再灌注肝功能損傷的保護(hù)作用并初步探討其作用的可能機(jī)制，得到以下結(jié)論:
　　一、氫生理鹽水能明顯減輕缺血再灌注誘導(dǎo)的肝損傷。
　　二、氫生理鹽水能有效抑制缺血再灌注肝組織氧化應(yīng)激。
　　三、氫生理鹽水能有效減輕缺血再灌注肝組織炎性反應(yīng)。
　　四、氫生理鹽水能明顯減輕缺血再灌注誘

8、導(dǎo)的肝細(xì)胞線粒體的氧化應(yīng)激。
　　五、氫生理鹽水能抑制肝細(xì)胞線粒體ATP消耗、呼吸控制率及磷氧比的降低來發(fā)揮肝損傷保護(hù)作用。
　　本論文以大鼠肝缺血再灌注損傷為實驗?zāi)Ｐ停瑧?yīng)用多種實驗方法研究了氫生理鹽水在體內(nèi)抗氧化、抑制炎性反應(yīng)、減輕肝細(xì)胞線粒體損傷的功能，初步驗證了氫生理鹽水能有效減輕缺血再灌注肝損傷，并能抑制肝組織氧化應(yīng)激和炎性反應(yīng)的作用，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)氫生理鹽水還可以減輕缺血再灌注誘導(dǎo)的肝細(xì)胞線粒體的氧化損傷，并通過增