輕度熱應激大鼠脾臟巨噬細胞免疫功能的研究.pdf

1、第一部分大鼠脾臟巨噬細胞的分離與培養(yǎng) 目的：分離培養(yǎng)并鑒定大鼠脾臟巨噬細胞。 方法：SD大鼠，腹腔注射水合氯醛麻醉，無菌取脾臟，制備成脾臟組織細胞混懸液，裂解脾臟組織細胞混懸液中的紅細胞；用RPIM-1640培養(yǎng)基重懸沉淀，接種于一次性塑料培養(yǎng)瓶中，在37℃，50ml·l-1CO2，100％濕度中分別培養(yǎng)1、2、3、6、12、24h，洗滌未貼壁細胞，相差顯微鏡下分別觀察脾臟巨噬細胞的貼壁情況，確定最佳細胞貼壁時間。應用免

2、疫組織化學等方法進行細胞的鑒定；臺盼藍染色鑒定細胞活力，瑞氏染色鑒定細胞純度。 結果：1.大鼠脾臟組織經過研磨等處理后，得到大量的脾細胞混懸液，可以滿足進一步的分離培養(yǎng)的需要；2.觀察貼壁細胞，1-3h細胞少量貼壁，12h左右的貼壁細胞增多，24h的貼壁細胞減少。12h是貼壁細胞合適時間；3.相差顯微鏡下觀察到貼壁培養(yǎng)的脾臟巨噬細胞多為圓形或橢圓形，少數呈梭形或多邊形。鏡下觀察細胞體積較大，細胞膜完整，細胞核清晰可見，胞漿內容物

3、豐富；免疫組織化學結果顯示貼壁的脾臟巨噬細胞CD68表達陽性，提示所得的細胞是脾臟巨噬細胞，臺盼藍染色顯示細胞活力>95％，瑞氏染色鑒定細胞純度>90％。 結論：1分離培養(yǎng)出活力和純度符合實驗要求的大鼠脾臟巨噬細胞；2.貼壁12h是大鼠原代脾臟巨噬細胞的合適貼壁培養(yǎng)時間。 第二部分輕度熱應激對大鼠脾臟巨噬細胞免疫功能的影響 目的：探討輕度熱應激對大鼠脾臟巨噬細胞免疫功能的影響。 方法：以始終處于37℃的大

4、鼠原代脾臟巨噬細胞作為對照組，實驗組將大鼠原代脾臟巨噬細胞置于41℃恒溫箱中，使細胞輕度熱應激1h，然后恢復到37℃，分成應激后0min，30min，60min，120min，180min五個亞組組，總共六個組；以吞噬中性紅能力（OD540nm值）檢測巨噬細胞的吞噬功能、噻唑藍法測定巨噬細胞對L1210細胞的殺傷作用來反應巨噬細胞的殺傷活性，Transwell小室趨化裝置觀察巨噬細胞趨化活性變化；采用雙抗夾心ABC-ELISA法檢測大鼠

5、脾臟巨噬細胞分泌的TNF-a，IL-12濃度的變化。 結果：輕度熱應激（41℃、1h）后，實驗組大鼠脾臟巨噬細胞的功能均發(fā)生了變化，而且與應激后恢復時間有關。熱應激后0min，巨噬細胞的OD540nm值由正常的0.21±0.01上升到0.34±0.01（p<0.05），然后繼續(xù)上升，至60min達最高值0.81±0.04（p<0.01），隨后逐漸下降，應激后180min仍然有0.47±0.03（與對照組比較，p<0.05）；殺傷

6、活性由正常的35.30±4.37％上升到應激后0min的45.00±4.74％（p<0.05），在60min分鐘達到最大值82.07±5.17％（p<0.01），隨后逐漸下降，180min后殺傷活性基本恢復正常，為37.27±5.11％（與對照組比較，p>0.05）；趨化作用也呈現(xiàn)大致相同的變化趨勢，大鼠脾臟巨噬細胞正常趨化活性為23.40±5.32/HP；熱應激1h后0min為34.60±5.22/HP（p<0.05），在60min分

7、鐘達到最大值60.80±4.02/HP（p<0.01）后逐漸下降，180min仍為31.60±4.21/HP（與對照組比較，p<0.05）；在實驗時間內，大鼠脾臟巨噬細胞分泌的TNF-α和IL-12均隨著應激后時間的延長而增多，180min達到最高（與對照組比較，P<0.01）。 結論：輕度熱應激后，大鼠脾臟巨噬細胞的吞噬功能、殺傷活性、趨化活性都有上調；在實驗時間內，大鼠脾臟巨噬細胞分泌的細胞因子TNF-α和IL-12在輕度熱

8、應激后隨著時間的延長而增加。提示輕度熱應激對大鼠脾臟巨噬細胞的免疫功能有促進作用。 第三部分 Bip蛋白在輕度熱應激大鼠脾臟巨噬細胞中的表達與意義 目的：探討輕度熱應激大鼠脾臟巨噬細胞Bip蛋白的表達及其對細胞功能改變的影響。 方法：原代培養(yǎng)大鼠脾臟巨噬細胞，將細胞置于41℃恒溫箱中，使細胞輕度熱應激，1h后恢復到37℃，分別檢測應激后0min，30min，60min，120min，180min巨噬細胞BipmR

9、NA、Bip蛋白的表達：同時段分別檢測巨噬細胞吞噬功能、殺傷活性和趨化作用。 結果：（1）輕度熱應激后，大鼠脾臟巨噬細胞BipmRNA的表達明顯增加，30min后到達高峰，60min、120min時仍高于對照組（p<0.01），180min后恢復至正常水平。Bip蛋白的表達在輕度熱應激60min后到達高峰，120min、180min時仍高于對照組（p<0.05）。（2）輕度熱應激后，大鼠脾臟巨噬細胞的吞噬功能、殺傷活性和趨化作用

10、均明顯增強，且與BipmRNA、Bip蛋白表達的改變基本同步。 結論：輕度熱應激大鼠脾臟巨噬細胞BipmRNA、Bip蛋白的表達與巨噬細胞功能發(fā)生同步改變，提示Bip蛋白表達上調與輕度熱應激大鼠脾臟巨噬細胞功能增強可能有關。 第四部分 BiP反義寡核苷酸對輕度熱應激大鼠脾臟巨噬細胞免疫功能的影響 目的：探討B(tài)ip反義寡核苷酸對體外輕度熱應激大鼠脾臟巨噬細胞功能的影響，進一步證實Bip在輕度熱應激大鼠脾臟巨噬細胞功

11、能改變中的作用。 方法：設計特異性Bip寡核苷酸，反義序列為5’-CTTTGTCCTAGCCGCTCG-3’；錯義序列為5’-CTTTGTCCTAGCCGCTCG-3’。通過脂質體包裹后將其轉染至小鼠脾臟巨噬細胞，觀察Bip反義寡核苷酸轉染后及未轉染組、Bip錯義寡核苷酸轉染后大鼠脾臟巨噬細胞BipmRNA的改變：然后分別觀察正常對照組、輕度熱應激組和Bip反義寡核苷酸轉染并輕度熱應激后脾臟巨噬細胞功能的改變。 結果：B

12、ip反義寡核苷酸轉染大鼠脾臟巨噬細胞后，與未轉染組和錯義組比較，輕度熱應激后BipmRNA的表達明顯減少；大鼠脾臟巨噬細胞吞噬功能、趨化活性和殺傷活性明顯回落（P<0.01）。 結論：Bip反義寡核苷酸可顯著抑制大鼠脾臟巨噬細胞BipmRNA的表達，并可降低輕度熱應激大鼠脾臟巨噬細胞吞噬功能、趨化活性和殺傷活性。Bip對輕度熱應激大鼠脾臟巨噬細胞的免疫功能有促進作用。 第五部分 P38MAPK信號途徑在輕度熱應激大鼠脾臟

13、巨噬細胞免疫功能改變中的作用 目的：研究MAPK信號途徑在Bip蛋白介導的體外輕度熱應激大鼠脾臟巨噬細胞免疫功能改變中的作用。 方法：P38MAPK抑制劑預處理大鼠脾臟巨噬細胞，將細胞置于41℃恒溫箱中，使細胞輕度熱應激，1h后恢復到37℃（抑制組），以未應激（對照組）和單純41℃熱應激1h后60min大鼠脾臟巨噬細胞（應激組）為對照，分別檢測三組大鼠脾臟巨噬細胞吞噬、殺傷、趨化功能。同時檢測P38MAPK蛋白和Bip蛋

14、白的表達。 結果：輕度熱應激后60min，應激組大鼠脾臟巨噬細胞吞噬、趨化和殺傷活性增強，與對照組、抑制組比較差異有顯著性（P<0.01）。P38MAPK抑制劑預處理大鼠脾臟巨噬細胞，與應激組比較，熱應激后巨噬細胞吞噬、趨化和殺傷活性明顯降低（P<0.01），與對照組比較無顯著差異（P>0.05）。應激組P38MAPK蛋白表達明顯上調，與對照組和抑制組比較差異有顯著性（P<0.01）；P38MAPK抑制劑預處理后，抑制組P38M

15、APK蛋白表達受到抑制，與應激組比較（P<0.01）。Bip蛋白的表達也因P38MAPK抑制劑預處理而發(fā)生改變，由應激組的1.2702±0.5345（Bip/β-actin）下降到抑制組的1.0281±1.0614（P<0.05）。 結論：輕度熱應激可增強大鼠巨噬細胞吞噬、趨化和殺傷作用的同時，P38MAPK、Bip蛋白表達上調。P38MAPK抑制劑可顯著抑制大鼠巨噬細胞吞噬、趨化和殺傷功能以及P38MAPK、Bip蛋白的表達。