脾臟巨噬細(xì)胞通過(guò)exosomes傳遞抗原給樹(shù)突狀細(xì)胞參與CD4+T細(xì)胞免疫反應(yīng).pdf

1、目的：
　　以當(dāng)前國(guó)內(nèi)外尚未深入探討的體內(nèi)巨噬細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞在免疫反應(yīng)中的相互作用的研究現(xiàn)狀為契機(jī)，以現(xiàn)代細(xì)胞免疫學(xué)和分子免疫學(xué)方法為研究手段。聯(lián)合應(yīng)用Baft3-/-和CX3 CR1GFP/GFP等各種缺陷鼠模型，研究脾臟巨噬細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞在抗原誘導(dǎo)的CD4+T細(xì)胞免疫反應(yīng)中的作用，為闡明體內(nèi)專職抗原提呈細(xì)胞參與和調(diào)節(jié)特異性免疫應(yīng)答的機(jī)理提供一定的理論基礎(chǔ)。
　　方法：
　　1.C57BL/6小鼠胸腺單細(xì)胞懸液經(jīng)

2、20Gy X射線輻照誘導(dǎo)凋亡后，10mg/ml的OVAⅥ級(jí)蛋白及含有1％BSA1640培養(yǎng)基37℃孵育4h，制備細(xì)胞相關(guān)抗原。
　　2.C57BL/6小鼠尾靜脈回輸標(biāo)記有e450熒光染料的CD45.1細(xì)胞相關(guān)抗原，1h后處死小鼠，制備脾臟單細(xì)胞懸液;同時(shí)留取脾臟組織進(jìn)行冰凍切片。通過(guò)FACS及免疫組織熒光染色分析小鼠脾臟內(nèi)吞噬細(xì)胞吞噬抗原的能力。
　　3.C57BL/6小鼠尾靜脈注射脂質(zhì)體（200ul/只）后day1、5、1

3、2的前一日尾靜脈回輸106個(gè)CD45.1與OTⅡ雜交小鼠的CD4+Vβ5+Vα2+T細(xì)胞（標(biāo)記e450），并于當(dāng)日尾靜脈回輸細(xì)胞相關(guān)抗原，同時(shí)設(shè)正常C57BL/6小鼠為正常對(duì)照組，3d后檢測(cè)CD4+CD45.1+T細(xì)胞增殖比例、e450分裂峰及細(xì)胞絕對(duì)計(jì)數(shù)。
　　4.Batf3/轉(zhuǎn)基因小鼠尾靜脈回輸CD45.1與OTⅡ雜交小鼠的CD4+Vβ5+Vα2+T細(xì)胞，次日尾靜脈回輸細(xì)胞相關(guān)抗原，同時(shí)設(shè)正常C57BL/6小鼠為正常對(duì)照組，3

4、d后檢測(cè)CD4+CD45.1+的增殖比例及細(xì)胞絕對(duì)計(jì)數(shù)。
　　5.C57BL/6小鼠尾靜脈回輸細(xì)胞相關(guān)抗原1h后分選其脾臟巨噬細(xì)胞及DC，同時(shí)分選OTⅡ小鼠的CD4+Vβ5+Vα2+T細(xì)胞（標(biāo)記e450），進(jìn)行巨噬細(xì)胞與T細(xì)胞，DC與T細(xì)胞，巨噬細(xì)胞、DC共同與T細(xì)胞體外共培養(yǎng)，96h后檢測(cè)T細(xì)胞的增殖。
　　6.分選回輸細(xì)胞相關(guān)抗原（標(biāo)記e450）1h后的脾臟巨噬細(xì)胞與Naive小鼠的脾臟DC共培養(yǎng)，分別于1h、3h、4h

5、、5h，F(xiàn)ACS檢測(cè)巨噬細(xì)胞向DC傳遞細(xì)胞相關(guān)抗原(e450+)的能力。
　　7.分選回輸細(xì)胞相關(guān)抗原(標(biāo)記e450)1h后的脾臟巨噬細(xì)胞，Naive小鼠的脾臟DC以及DC、巨噬細(xì)胞共同與T細(xì)胞共培養(yǎng)3d后，檢測(cè)CD4+CD45.1+的增殖比例和e450的分裂峰。
　　8.C57BL/6小鼠尾靜脈回輸CD45.1與OTⅡ雜交小鼠的CD4+Vβ5+Vα2+T細(xì)胞（標(biāo)記e450），次日腹腔注射G蛋白偶聯(lián)受體抑制劑百日咳毒素(PT

6、x)500ng/只，8h后尾靜脈回輸細(xì)胞相關(guān)抗原，同時(shí)再次腹腔注射百日咳毒素(PTx)500ng/只，同時(shí)設(shè)正常C57BL/6小鼠為正常對(duì)照組，3d后檢測(cè)CD4+CD45.1+的增殖比例，e450的分裂峰并進(jìn)行細(xì)胞絕對(duì)計(jì)數(shù)。
　　9.CX3CR1GFP/GFP小鼠尾靜脈回輸CD45.1與OTⅡ雜交小鼠的CD4+Vβ5+Vα2+T細(xì)胞（標(biāo)記e450），次日尾靜脈回輸細(xì)胞相關(guān)抗原，同時(shí)設(shè)正常C57BL/6小鼠為正常對(duì)照組，3d后檢測(cè)C

7、D4+CD45.1+的增殖比例， e450的分裂峰并進(jìn)行細(xì)胞絕對(duì)計(jì)數(shù)。
　　10.C57BL/6小鼠連續(xù)2d腹腔注射exosome抑制劑GW4869（1.25mgkg/天），第3d同時(shí)尾靜脈回輸CD45.1與OTⅡ雜交小鼠的CD4+Vβ5+Vα2+T細(xì)胞，第4d同時(shí)尾靜脈回輸細(xì)胞相關(guān)抗原，之后再連續(xù)2d腹腔注射GW4869，第7d檢測(cè)CD4+CD45.1+的增殖比例， e450的分裂峰并進(jìn)行細(xì)胞絕對(duì)計(jì)數(shù)。設(shè)立腹腔注射GW4869溶

8、解劑DMSO(50ul/只/天)小鼠為對(duì)照組。
　　結(jié)果：
　　1.小鼠脾臟內(nèi)多種吞噬細(xì)胞具有吞噬細(xì)胞相關(guān)抗原的能力，其中包括巨噬細(xì)胞（吞噬細(xì)胞相關(guān)抗原總量的16％）、LDC(吞噬細(xì)胞相關(guān)抗原總量的19％) mDC（吞噬細(xì)胞相關(guān)抗原總量的1.5％）和pDC（吞噬細(xì)胞相關(guān)抗原總量的3.2％）等專職抗原提呈細(xì)胞以及小吞噬細(xì)胞如中性粒細(xì)胞（吞噬細(xì)胞相關(guān)抗原總量的18.6％）。
　　2.靜脈注射脂質(zhì)體1d后，與正常對(duì)照組相比，

9、注射CL組中脾臟mDC的清除率為50％，LDC清除率為99％，cDC清除率為50％，F(xiàn)4/80+ MФ清除率為100％，同時(shí)通過(guò)免疫熒光染色觀察CD169和Marco兩群巨噬細(xì)胞基本全部清除;注射CL5d后，mDC、LDC及cDC基本完全恢復(fù);而F4/80 MФ清除率仍為100％，CD169和Marco兩群巨噬細(xì)胞也基本全部清除;注射CL12d后，F(xiàn)4/80 MФ恢復(fù)到正常水平的67％，CD169和Marco兩群巨噬細(xì)胞大部分恢復(fù)。

10、r>　　3.注射CL1d、5d、12d后，與正常對(duì)照組相比，CD4+CD45.1+T細(xì)胞增殖的比例分別下降80％、60％、20％。
　　4.與正常對(duì)照組相比，Batf3/-轉(zhuǎn)基因小鼠中CD4+CD45.1+T細(xì)胞增殖的比例下降70％。
　　5.巨噬細(xì)胞與T細(xì)胞共培養(yǎng)3d后， T細(xì)胞增殖微弱(e-450分裂峰陽(yáng)性率為3.39％);巨噬細(xì)胞與T細(xì)胞共培養(yǎng)后，T細(xì)胞增殖的e-450分裂峰陽(yáng)性率為22.6％;DC、巨噬細(xì)胞共同與T細(xì)

11、胞共培養(yǎng)時(shí)，T細(xì)胞增殖的e-450分裂峰陽(yáng)性率為38.1％。結(jié)果顯示:脾臟巨噬細(xì)胞與DC各自與T細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)，其T細(xì)胞的增殖均低于這兩群細(xì)胞共同與T細(xì)胞培養(yǎng)組。
　　6.回輸細(xì)胞相關(guān)抗原（標(biāo)記e450）1h后的脾臟巨噬細(xì)胞與Naive小鼠的脾臟DC共孵育1h、3h、4h、5h后，巨噬細(xì)胞向DC傳遞抗原的百分比分別為0.12％，0.7％，1.07％和1.55％。結(jié)果顯示，隨著時(shí)間延長(zhǎng)，F(xiàn)4/80+巨噬細(xì)胞向DC傳遞抗原的數(shù)量亦在增加。

12、
　　7.回輸細(xì)胞相關(guān)抗原（標(biāo)記e450）1h后的脾臟巨噬細(xì)胞，Naive小鼠的脾臟DC以及DC、巨噬細(xì)胞共同與T細(xì)胞共培養(yǎng)后，T細(xì)胞增殖的e-450分裂峰陽(yáng)性率分別為33.5％，2.97％，55.6％;結(jié)果顯示，DC、巨噬細(xì)胞共同與T細(xì)胞共培養(yǎng)后，抗原特異的CD4+T細(xì)胞增殖能力明顯上調(diào)
　　8.小鼠腹腔注射PTx阻止細(xì)胞遷移后，CD4+CD45.1+T細(xì)胞增殖的比例與正常對(duì)照組相比下降70％。CX3CR1GFP/GFP小