BCG誘導(dǎo)小鼠樹突狀細(xì)胞和巨噬細(xì)胞抗原提呈功能及其機(jī)制研究.pdf

1、結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌復(fù)合物（M.tuberculosis complex）感染引起的一種嚴(yán)重危害人類健康的傳染性疾病，每年導(dǎo)致大約860萬結(jié)核病新發(fā)病例和130萬左右患者死亡?？ń槊纾˙acillus Calmette-Guérin，BCG）作為一種1920年代發(fā)展的牛分枝桿菌(M.bovis)減毒活疫苗，目前仍然在全世界范圍內(nèi)用于免疫接種兒童。
　　Ag85復(fù)合物是結(jié)核分枝桿菌(M.tuberculosis)、牛分枝桿菌（M.

2、bovis）及BCG等主要的分泌性濾液蛋白，主要包括3個組分Ag85A、Ag85B和Ag85C，大小分別為31 kDa、30kDa和31.5 kDa，大約以3∶2∶1的比例分泌于培養(yǎng)液中。Ag85復(fù)合物具有分枝酰轉(zhuǎn)移酶活性，是維持分枝桿菌細(xì)胞壁完整性的重要結(jié)構(gòu)。近年來研究表明，Ag85A蛋白可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生強(qiáng)烈的CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞免疫應(yīng)答，是目前最具潛力的疫苗候選抗原之一。
　　樹突狀細(xì)胞(dendritic cell，

3、DC)和巨噬細(xì)胞(macrophage，MΦ)作為機(jī)體內(nèi)單核吞噬系統(tǒng)主要成員，都起源于骨髓內(nèi)未分化的造血干細(xì)胞，并且具有相似的免疫功能:DC和MΦ都可以吞噬入侵的病原體，通過胞內(nèi)各種效應(yīng)物質(zhì)對其進(jìn)行殺傷清除;兩者都可以通過表面及胞內(nèi)受體識別病原體及其組分，介導(dǎo)炎癥反應(yīng)及一系列天然免疫應(yīng)答;兩者都可以加工處理及提呈外源抗原，激活T細(xì)胞并誘導(dǎo)獲得性免疫應(yīng)答。但是作為機(jī)體免疫防御體系的重要組成部分，DC和MΦ針對分枝桿菌抗原的抗原提呈功能及機(jī)

4、制還需要進(jìn)入深入的研究。
　　本文首先對Ag85A蛋白及BCG誘導(dǎo)機(jī)體特異性獲得性免疫應(yīng)答規(guī)律進(jìn)行了研究;隨后分別在體外及體內(nèi)條件下探討了BCG感染早期C57BL/6小鼠DC和MΦ產(chǎn)生針對Ag85A特異性抗原提呈活性在內(nèi)的一系列免疫應(yīng)答功能規(guī)律;并對BCG感染早期C57BL/6小鼠DC和MΦ的84種免疫相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄譜進(jìn)行了比較分析，為深入揭示DC和MΦ發(fā)揮抗原提呈功能的細(xì)胞及分子機(jī)制提供線索。
　　1.牛分枝桿菌BCGAg8

5、5A蛋白的可溶性原核表達(dá)及免疫應(yīng)答特性研究
　　通過使用冷休克表達(dá)系統(tǒng)和含有伴侶蛋白質(zhì)粒的宿主菌，成功實現(xiàn)了Ag85A蛋白的可溶性原核表達(dá)，通過親和層析純化和Western blot鑒定，結(jié)果顯示其具有較好的免疫反應(yīng)性。Ag85A蛋白免疫C57BL/6小鼠后，血清中檢測到高水平的IgG抗體效價，表明Ag85A蛋白可以誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生強(qiáng)烈的體液免疫應(yīng)答。通過對特異性抗原刺激的脾臟和腹股溝淋巴結(jié)細(xì)胞分泌細(xì)胞因子進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示培養(yǎng)上清中

6、檢測到高水平的IFN-γ、TNF-α等Th1型細(xì)胞因子，而IL-4、IL-6等Th2型細(xì)胞因子的產(chǎn)生水平較低。另外小鼠脾臟和腹股溝淋巴結(jié)中CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞比值均有所上升，表明Ag85A蛋白可以誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生強(qiáng)烈的特異性Th1型細(xì)胞免疫應(yīng)答。
　　2.BCG、增強(qiáng)表達(dá)Ag85A重組BCG誘導(dǎo)的針對Ag85A特異性免疫應(yīng)答研究
　　BCG免疫C57BL/6小鼠后，血清中檢測到高水平的Ag85A特異性IgG抗體效價，表

7、明BCG可以誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生強(qiáng)烈針對Ag85A的體液免疫應(yīng)答。通過對特異性抗原刺激的脾臟和腹股溝淋巴結(jié)細(xì)胞分泌細(xì)胞因子進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示培養(yǎng)上清中檢測到高水平的IFN-γ、TNF-α等Th1型細(xì)胞因子，而IL-4、IL-6等Th2型細(xì)胞因子的產(chǎn)生水平較低。另外小鼠脾臟和腹股溝淋巴結(jié)中CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞比值均顯著上升，表明BCG可以誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生強(qiáng)烈的針對Ag85A特異性Th1型細(xì)胞免疫應(yīng)答。通過分枝桿菌穿梭質(zhì)粒pMV261構(gòu)建了增

8、強(qiáng)表達(dá)Ag85A抗原的重組BCG，Western blot和ELISA實驗結(jié)果顯示，與BCG相比，重組BCG菌體中Ag85A蛋白含量明顯增加，表明Ag85A蛋白在重組BCG中成功實現(xiàn)增強(qiáng)表達(dá)。隨后對重組BCG免疫C57BL/6小鼠后誘導(dǎo)機(jī)體特異性免疫應(yīng)答水平測定結(jié)果顯示，小鼠血清中特異性Ag85A抗體水平以及脾臟和腹股溝淋巴結(jié)細(xì)胞經(jīng)特異性抗原刺激后IFN-γ分泌水平均顯著上升，表明其可能具有更好的免疫保護(hù)效果，顯示出其作為結(jié)核病疫苗研發(fā)

9、的前景。
　　3.BCG體外感染小鼠樹突狀細(xì)胞和巨噬細(xì)胞抗原提呈功能研究
　　使用不同MOI值rBCG-GFP分別進(jìn)行體外感染磁分選C57BL/6小鼠脾臟DCs和MΦs，結(jié)果顯示，MΦs的感染比例顯著高于DCs，表明小鼠脾臟MΦs對于分枝桿菌的吞噬能力要強(qiáng)于脾臟DCs。BCG感染后，小鼠脾臟DCs和MΦs胞內(nèi)的ROS水平均有所上升，DCs胞內(nèi)的iNOS水平有所上升，而MΦs胞內(nèi)的iNOS含量似乎呈現(xiàn)下降的趨勢。另外，MΦ胞內(nèi)

10、的ROS、iNOS和NO含量均要高于DCs，表明BCG感染后小鼠脾臟MΦs的殺傷活性要高于小鼠DCs。對BCG體外感染小鼠脾臟DCs和MΦs分泌的細(xì)胞因子測定結(jié)果顯示BCG感染后小鼠脾臟DCs產(chǎn)生較高水平的IL-6、IFN-γ和TNF-α，小鼠脾臟MΦs分泌較高水平的TNF-α和IL-10，以及一定水平的MCP-1，表明巨噬細(xì)胞在分泌炎性因子誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)過程中發(fā)揮重要作用，而樹突狀細(xì)胞則側(cè)重于啟動機(jī)體T細(xì)胞免疫應(yīng)答。體外抗原提呈試驗結(jié)果

11、顯示，使用Ag85A多肽、Ag85A蛋白、BCG對小鼠脾臟DCs和MΦs進(jìn)行刺激培養(yǎng)，小鼠脾臟DCs和MΦs均可以檢測到特異性抗原提呈信號，且DCs的抗原提呈活性更高，表明小鼠脾臟DCs和MΦs均具有針對BCG表達(dá)Ag85A蛋白的特異性抗原提呈功能。
　　4.BCG體內(nèi)感染小鼠樹突狀細(xì)胞和巨噬細(xì)胞抗原提呈功能研究
　　使用rBCG-GFP感染C57BL/6小鼠，并對小鼠體內(nèi)DCs和MΦs的感染比例進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示rBCG-

12、GFP尾靜脈注射后，其中脾臟DC的感染比例最高達(dá)到1％-2％左右;而MΦs感染比例在48h達(dá)到3.27％。而rBCG-GFP皮下注射后，腹股溝淋巴結(jié)DCs和MΦs感染比例均隨著時間的延長而不斷上升，在96h感染比例分別達(dá)到2.11％和5.53％。結(jié)果表明，在感染早期，小鼠MΦs針對BCG的吞噬感染水平要高于DCs。
　　對BCG皮下感染C57BL/6小鼠腹股溝淋巴結(jié)DC和MΦ胞內(nèi)的BCG菌CFU值進(jìn)行滴定，結(jié)果顯示小鼠腹股溝淋巴結(jié)

13、DCs和MΦs均感染有一定數(shù)目的BCG，在感染早期隨著時間的延長胞內(nèi)細(xì)菌數(shù)逐漸增多;并且MΦ胞內(nèi)的細(xì)菌數(shù)要高于DC，表明分枝桿菌感染早期，MΦ對于BCG的吞噬能力要強(qiáng)于DC。大約7天后，MΦs胞內(nèi)細(xì)菌數(shù)有所下降，并且低于DCs，結(jié)果表明DC可能并不能有效清除胞內(nèi)感染的BCG，而MΦ則有著更高的清除殺傷活性。
　　BCG感染后小鼠腹股溝淋巴結(jié)DCs和MΦs表面MHCⅡ分子以及CD40、CD80和CD86等共刺激分子表達(dá)水平檢測結(jié)果顯

14、示，在BCG皮下感染12h后DCs表面分子均呈現(xiàn)上調(diào)趨勢，隨后逐漸下降;而MΦs表面MHCⅡ和CD40分子表達(dá)水平呈現(xiàn)緩慢上升的趨勢，但是MΦs表面上述與抗原提呈及T細(xì)胞活化相關(guān)分子的表達(dá)水平仍然低于DCs，表明BCG感染后小鼠體內(nèi)只有DCs得以有效活化。
　　對于BCG體內(nèi)感染后小鼠DCs和MΦs針對BCG表達(dá)Ag85A特異性抗原提呈作用規(guī)律的研究結(jié)果顯示，尾靜脈注射Ag85A蛋白后，小鼠脾臟DCs和MΦs均可以檢測到一定水平的

15、抗原提呈活性信號，并且在4h后信號達(dá)到高峰。Ag85A蛋白通過皮下注射后，信號有所延遲，注射24h后檢測到DCs和MΦs產(chǎn)生抗原提呈信號。而使用BCG皮下感染C57BL/6小鼠后，小鼠腹股溝淋巴結(jié)DCs在12-24h左右產(chǎn)生高水平的抗原加工提呈活性，在96h小時后信號消失，而腹股溝淋巴結(jié)MΦs則沒有檢測到信號。上述結(jié)果表明，在BCG體內(nèi)感染早期， DCs可以對Ag85A抗原進(jìn)行有效抗原提呈，并且抗原提呈信號短時間內(nèi)迅速消失，而巨噬細(xì)胞沒

16、有產(chǎn)生特異性抗原提呈活性。
　　5.BCG體內(nèi)感染小鼠樹突狀細(xì)胞和巨噬細(xì)胞免疫相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄譜分析
　　本研究通過RT2 Profiler PCR Array方法對BCG皮下感染12h和48h的C57BL/6小鼠腹股溝淋巴結(jié)DCs和MΦs的84種免疫相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄譜進(jìn)行了比較分析。結(jié)果顯示，BCG感染早期，小鼠DCs和MΦs大量基因顯著上調(diào)，數(shù)目及水平均高于下調(diào)基因，表明小鼠DCs和MΦs啟動一系列免疫基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，進(jìn)而發(fā)揮各

17、種免疫應(yīng)答效應(yīng);同時小鼠DCs和MΦs顯著上調(diào)基因數(shù)目及變化水平隨著感染時間延長而逐漸下降，表明兩種細(xì)胞抗結(jié)核分枝桿菌免疫應(yīng)答效應(yīng)處于逐漸降低的趨勢;小鼠DCs參與抗原提呈及T細(xì)胞活化的基因轉(zhuǎn)錄水平要高于MΦs，而MΦs表面識別受體、炎性因子基因的轉(zhuǎn)錄水平變化要更高，進(jìn)一步證實了DCs功能側(cè)重于抗原提呈、誘導(dǎo)T細(xì)胞免疫應(yīng)答，而MΦs主要發(fā)揮病原吞噬殺傷、誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)的作用。一些潛在功能相關(guān)基因的搜尋為小鼠DCs和MΦs抗原提呈功能機(jī)制的