蛋氨酸腦啡肽對小鼠樹突狀細胞分化誘導(dǎo)和功能調(diào)控機制的研究.pdf

1、實驗?zāi)康?
　　 通過蛋氨酸腦啡肽(MENK)在體內(nèi)外對小鼠骨髓來源樹突狀細胞(DC)亞群分化的誘導(dǎo),樹突狀細胞免疫表型、生物學(xué)活性、抗原提呈功能的調(diào)控,從而探討MENK調(diào)控鼠骨髓來源樹突狀細胞分化、誘導(dǎo)Th1型免疫應(yīng)答及抗腫瘤的作用的機制。為進一步發(fā)掘DCs的免疫潛能,使其在抗腫瘤反應(yīng)中發(fā)揮最大作用奠定基礎(chǔ),繼而為腫瘤的治療提供廣闊的前景。
　　 實驗方法:
　　 首先,研究蛋氨酸腦啡肽對小鼠樹突狀細胞亞型分化

2、的誘導(dǎo)及調(diào)控。從7-8周齡的C57BL/6小鼠骨髓提取骨髓細胞誘導(dǎo)培養(yǎng),經(jīng)CD11c免疫磁珠分選,獲得純化的樹突狀細胞。流式細胞儀分析表明,CD11c(樹突狀細胞的特異性標記)陽性細胞純度達85%以上。采用倒置熒光顯微鏡觀察不同濃度的(10-8-10-14mol/L)MENK體外誘導(dǎo)的樹突狀細胞的形態(tài)變化,采用流式細胞儀分析梯度濃度的MENK體外誘導(dǎo)骨髓樹突狀細胞前體后其CD11c+CD11b+DC和CD11c+CD11b'CD45R/

3、B220+DC亞群的變化規(guī)律和固定量的MENK(20mg/kg注射量)體內(nèi)誘導(dǎo)DC亞群分化的特點,以及體內(nèi)外共刺激分子CD80,CD40和MHC-Ⅱ分子的表達進而確定MENK體外最佳誘導(dǎo)濃度。其次,研究蛋氨酸腦啡肽對樹突狀狀細胞免疫學(xué)功能的調(diào)控。用酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法,檢測了不同體外誘導(dǎo)條件下,各組骨髓樹突狀細胞前體來源的樹突狀細胞上清中的IL-12p70和IL-10含量,進而從誘導(dǎo)的樹突狀細胞分泌細胞因子的特點判斷MENK對T

4、h1/Th2型反應(yīng)的定向調(diào)控;同時用RT-PCR的方法檢測了各組誘導(dǎo)的樹突狀細胞其κ,δ,μ阿片受體及細胞內(nèi)TNF-α和TLR-4的mRNA水平;在誘導(dǎo)的樹突狀細胞和T淋巴細胞共培養(yǎng)的條件下,用MTr法測定了T淋巴細胞的增殖能力;采用MTT法配合倒置熒光顯微鏡和流式細胞術(shù)測定了10-12mol/LMENK(MENK-12),LPS,IL-3,G+I誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)的樹突狀細胞的對MCF-7腫瘤細胞的抑制率及體外凋亡的情況;同時采用Tweste

5、rn-Blot檢測了體外誘導(dǎo)的樹突狀細胞凋亡蛋白TRAIL蛋白的分泌情況。在體內(nèi)試驗中,制備了荷瘤鼠模型,在MENK(20mg/kg注射量)的作用下,采用流式細胞儀檢測了體內(nèi)樹突狀細胞誘導(dǎo)腫瘤凋亡的能力并比較了小鼠的生存率、抑瘤率;同時將用MENK-12體外誘導(dǎo)的樹突狀細胞進行了體內(nèi)回輸檢測其生存率、抑瘤率。最后,在MENK對樹突狀細胞亞群分化誘導(dǎo)及免疫學(xué)功能調(diào)控的的基礎(chǔ)上,進一步探討了MENK對樹突狀細信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路TLR-4-NF-κ

6、b信號活化的意義。用Westen-Blot的方法,定量檢測了MENK對樹突狀細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路相關(guān)蛋白NF-κb和TLR-4的表達。
　　 實驗結(jié)果:
　　 1、在樹突狀細胞亞群分化方面,無論是在體內(nèi)還是在體外,MENK均定向的誘導(dǎo)樹突狀細胞像髓系發(fā)展,在體外誘導(dǎo)中,在MENK濃度為10-12mol/L的時,共刺激分子CD80,CD40,MHCⅡ達到最高值,表明MENK是最佳誘導(dǎo)濃度是10-12mol/L。
　　

7、2、ELISA結(jié)果表明MENK-12(10-12mol/LMENK)誘導(dǎo)樹突狀細胞分泌的IL-12p70的含量高于IL-10,表明MENK-12能夠定向誘導(dǎo)TH1型反應(yīng),RT-PCR的結(jié)果表明,經(jīng)MENK-12誘導(dǎo)的的樹突狀細胞能夠上調(diào)阿片受體及細胞內(nèi)TNF-α和TLR-4的mRNA水平。Western-Blot檢測結(jié)果證實了MENK-12增加了樹突狀細胞分泌TRAIL蛋白的的能力。MTT結(jié)果表明MENK-12能夠刺激樹突狀細胞刺激同種

8、異體T淋巴細胞的增殖能力,流式結(jié)果表明MENK在體內(nèi)外均能誘導(dǎo)腫瘤細胞的凋亡壞死并可以顯著抑制荷瘤小鼠體內(nèi)腫瘤的生長,延長荷瘤小鼠的生存時間,其生存率明顯高于模型對照組。
　　 3、Western-Blot結(jié)果表明MENK-12能夠上調(diào)骨髓樹突狀細胞前體來源的樹突狀細胞TLR-4的表達,從而活化TNF-κb信號通路。
　　 結(jié)論:
　　 1、MENK能夠在體內(nèi)外誘導(dǎo)樹突狀細胞向髓系分化,并且上調(diào)共刺激分子的表達。