GSK-3β對小鼠骨髓樹突狀細(xì)胞成熟和功能的作用及機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　本實驗構(gòu)建GSK-3β基因的過表達(dá)載體并轉(zhuǎn)染樹突狀細(xì)胞系DC2.4，觀察過表達(dá)GSK-3β對RelB蛋白水平的影響，以探究GSK-3β通過調(diào)節(jié)RelB的表達(dá)影響DC活化成熟的新機(jī)制，為確立GSK-3β作為自身免疫性疾病治療的新靶點提供充分的科學(xué)依據(jù)。
　　方法：
　　1.小鼠BMDC的體外培養(yǎng)和鑒定以及GSK-3β的活性檢測
　　采用我們實驗室建立的方法，以低劑量的rmGM-CSF和rmIL-4在體外

2、大規(guī)模誘導(dǎo)培養(yǎng)小鼠骨髓細(xì)胞分化成iDC和mDC。培養(yǎng)6天收集的細(xì)胞為iDC;收集前一天加入LPS刺激24h的細(xì)胞為mDC。兩種細(xì)胞均通過CD11c+免疫磁珠分選純化，并采用流式細(xì)胞術(shù)(FCM)檢測CD11c的陽性率以鑒定細(xì)胞純度、檢測表面共刺激分子CD40和CD86的表達(dá)以鑒定細(xì)胞表型;利用qRT-PCR檢測細(xì)胞因子表達(dá)情況;利用混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)(MLR)檢測DC刺激同種異基因T細(xì)胞增殖的能力。目的在于建立體外大規(guī)模培養(yǎng)iDC和mDC的

3、體系，為后續(xù)研究DC活化成熟的機(jī)制奠定實驗基礎(chǔ)。利用LPS處理iDC30min和60min，western blotting檢測GSK-3β的磷酸化水平，以觀察GSK-3β在LPS誘導(dǎo)DC活化成熟過程中的活性變化。
　　2.GSK-3β對小鼠BMDC成熟和功能的作用和機(jī)制
　　利用GSK-3β的活性抑制劑SB216763處理原代BMDC24h，觀察抑制GSK-3β的活性對BMDC成熟和功能的影響。FCM檢測表面共刺激分子CD

4、40和CD86的表達(dá)變化;qRT-PCR檢測細(xì)胞因子IL-6、IL-12和IL-10 mRNA的表達(dá);MLR檢測其功能的變化。構(gòu)建過表達(dá)GSK-3β的慢病毒載體并轉(zhuǎn)染細(xì)胞系DC2.4，western blotting檢測GSK-3β的過表達(dá)效率以及過表達(dá)GSK-3β對RelB蛋白水平表達(dá)的影響。
　　結(jié)果：
　　1.小鼠BMDC的體外培養(yǎng)和鑒定以及GSK-3β的活性檢測
　　1.1 小鼠骨髓樹突狀細(xì)胞體外培養(yǎng)觀察情況<

5、br>　　培養(yǎng)至第六天，iDC集落逐漸增多增大，大多數(shù)仍疏松貼壁生長。iDC體積增大并開始伸出細(xì)小突起。經(jīng)LPS刺激后，單個細(xì)胞從集落釋放成為懸浮細(xì)胞，其個體增大，表面突起明顯變長變粗，呈樹枝狀，具有典型mDC的形態(tài)特征。
　　1.2 小鼠BMDC的純度和表型鑒定
　　CD11c是經(jīng)典DC相對特異的表面標(biāo)志，細(xì)胞表面CD11c的陽性率代表DC的純度。我們利用免疫磁珠法純化收集的細(xì)胞，再利用FCM檢測細(xì)胞表面分子CD11c、C

6、D40和CD86的表達(dá)，鑒定細(xì)胞的純度和成熟度。經(jīng)磁珠分選后，DC的純度達(dá)到90％以上，符合分子生物學(xué)實驗的要求。iDC組低表達(dá)共刺激分子CD40和CD86，而mDC組高表達(dá)CD40和CD86，完全符合imDC和mDC的表型特征。
　　1.3 小鼠BMDC細(xì)胞因子IL-6和IL-12 mRNA的表達(dá)情況
　　收集兩組純化后的細(xì)胞，qRT-PCR法檢測IL-6和IL-12的表達(dá)。結(jié)果顯示，iDC中IL-6(P＜0.05)和IL

7、-12(P＜0.05)的mRNA水平顯著低于mDC。
　　1.4 單向MLR評價小鼠BMDC刺激T細(xì)胞增殖的功能
　　將兩組純化后的DC分別按1∶10的比例與初始T淋巴細(xì)胞混合培養(yǎng)72小時，用CCK-8法檢測T細(xì)胞的增殖情況。iDC組T細(xì)胞的相對增值率為(0.51±0.06)，mDC組為(1.14±1.20)，iDC組刺激T細(xì)胞活化的能力顯著低于mDC組(P＜0.01)。
　　1.5 GSK-3β在LPS誘導(dǎo)DC活化成

8、熟過程中的活性變化
　　iDC GSK-3β216位酪氨酸(Tyr216)的磷酸化水平較高，而第9位絲氨酸(Ser9)的磷酸化水平較低，說明iDC中GSK-3β具有較高的活性。在LPS刺激后，Ser9的磷酸化水平顯著高于未刺激組，相對應(yīng)的Tyr216第則明顯低于未刺激組，說明iDC經(jīng)LPS刺激活化后GSK-3β活性下降。
　　2.GSK-3β對小鼠BMDC成熟和功能的作用及機(jī)制
　　2.1 抑制GSK-3β的活性對BM

9、DC成熟和功能的影響
　　SB216763處理組與iDC組相比，表面共刺激分子CD40(P＜0.01)和CD86(P＜0.01)的表達(dá)顯著上調(diào)，分別是未處理組的2.5和2.4倍;促炎因子IL-6(P＜0.05)和IL-12(P＜0.05)mRNA水平顯著下調(diào)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，而抑炎因子IL-10 mRNA的表達(dá)顯著上調(diào)（P＜0.01）;SB216763處理組DC刺激同種異基因T細(xì)胞增殖的能力較弱，與iDC相比沒有顯著差異。說明抑

10、制GSK-3β促進(jìn)DC表型成熟，但是其對促炎細(xì)胞因子的表達(dá)起抑制作用，且其刺激MLR的能力相當(dāng)有限，提示抑制GSK-3β的活性不能激活DC完全成熟，經(jīng)SB216763處理的DC在功能上仍然屬于一種耐受型DC。另外，SB216763能夠抑制LPS誘導(dǎo)IL-6（P＜0.05）和IL-12(P＜0.01)的表達(dá)上調(diào)，促進(jìn)LPS誘導(dǎo)的IL-10的表達(dá)上調(diào)(P＜0.01)，阻斷經(jīng)LPS誘導(dǎo)成熟的DC刺激同種異基因T細(xì)胞增殖的功能，提示GSK-3β

11、在LPS刺激DC活化過程中發(fā)揮促炎作用。
　　2.2 抑制GSK-3β對RelB表達(dá)的影響
　　利用攜帶小鼠GSK-3β基因的慢病毒載體轉(zhuǎn)染DC2.4細(xì)胞，western blotting結(jié)果顯示，GSK-3β過表達(dá)組中GSK-3β的表達(dá)明顯高于空白對照組和空載轉(zhuǎn)染組，相對應(yīng)的RelB的表達(dá)低于空白對照組和空載轉(zhuǎn)染組，說明過表達(dá)GSK-3β能下調(diào)RelB蛋白的水平。
　　結(jié)論：
　　1.利用低濃度的rmGM-CS

12、F和rmIL-4刺激誘導(dǎo)小鼠BMDC分化形成大量的iDC，經(jīng)磁珠分選后其純度可達(dá)90％以上，iDC經(jīng)LPS誘導(dǎo)形成mDC。經(jīng)形態(tài)學(xué)、表型和功能分析，該方法培養(yǎng)的iDC和mDC完全符合DC的特征。
　　2.iDC中GSK-3β具有較高的活性，在LPS刺激后其活性顯著降低，提示LPS可能通過誘導(dǎo)GSK-3β的失活調(diào)節(jié)DC的活化和成熟過程。
　　3.GSK-3β參與DC活化成熟的調(diào)控機(jī)制，一方面，高活性的GSK-3β抑制iDC的自