自噬在硫化氫保護糖尿病心肌損傷中的作用的實驗研究.pdf

1、本文主要從以下幾個部分展開論述：
　　第一部分：本研究采用高脂喂養(yǎng)+小劑量鏈脲佐菌素(Streptozotocin，STZ)腹腔注射的方法建立2型糖尿病大鼠模型，在體內(nèi)探討自噬在糖尿病心肌病中的作用及H2S的干預(yù)研究。
　　目的：
　　1.構(gòu)建2型DCM大鼠動物模型;
　　2.明確自噬相關(guān)因子在2型DCM大鼠心肌內(nèi)的表達;
　　3.探討H2S對DCM的保護作用是否通過調(diào)節(jié)心肌細胞自噬實現(xiàn)。
　　方法：

2、
　　1.構(gòu)建2型糖尿病大鼠動物模型
　　5周齡雄性SD大鼠34只，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后隨機分為2組:對照組(N=10只)和糖尿病模型組(N=24只)。對照組大鼠喂以基礎(chǔ)飼料，糖尿病模型組大鼠喂以高脂飼料。4周后行腹腔葡萄糖耐量試驗(IPGTT)和腹腔胰島素耐量試驗(IPITT)，對經(jīng)高脂喂養(yǎng)后出現(xiàn)胰島素抵抗的大鼠一次性給予腹腔注射STZ40mg/kg。STZ注射1周后，測定FBG≥11.1 mmol/L者認為糖尿病模型構(gòu)建成功

3、。糖尿病模型組再次分為糖尿病對照組（DM組，N=12）和NaHS(H2S的外源性供體)治療組（DM+NaHS組，N=12）。NaHS+DM組予以腹腔注射NaHS溶液14μmol/（kg·d）。給藥6周后處死大鼠，留取標(biāo)本。
　　2.實驗?zāi)┻M行以下檢測:
　　(1)血清學(xué)指標(biāo)檢測包括:各組大鼠禁食過夜，收集外周靜脈血檢測空腹血糖(FBG)、總膽固醇(TC)和甘油三酯(TG)及空腹胰島素(FINS)水平等，計算胰島素敏感指數(shù)(I

4、SI)。
　　(2)血壓和心率的測量:利用大鼠尾動脈血壓測量儀測量大鼠尾動脈收縮壓(SBP)、舒張壓(DBP)、平均動脈壓(MBP)和心率(HR)，每只大鼠測量3次取平均值。
　　(3)超聲心動圖:分別測量左室收縮末期內(nèi)徑(LVESD)、左室舒張末期內(nèi)徑(LVEDD)、左室短軸縮短率(FS)并計算左室射血分數(shù)(LVEF);測量二尖瓣舒張早期血流速度峰值(E)和舒張晚期血流速度峰值(A)、E/A比值、E波減速時間(EDT);等

5、容舒張時間(IVRT)。依此來評價各組大鼠的左室舒張及收縮功能。
　　(4)組織形態(tài)學(xué)分析:通過HE和Masson染色，分別觀察心肌的形態(tài)結(jié)構(gòu)和心肌內(nèi)膠原的分布情況，定量分析心肌組織膠原含量，評價心肌纖維化程度。
　　(5) TUNEL染色:取各組大鼠的心臟組織切片行TUNEL染色檢測心肌細胞的凋亡率。
　　(6) Western blot檢測:提取各組大鼠的心肌組織蛋白，Western blot檢測心肌組織內(nèi)Bax、

6、Bcl-2、LC3、Atg5的蛋白表達。
　　所有數(shù)據(jù)用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行分析，連續(xù)變量以均數(shù)±標(biāo)準差(Mean±SD)表示，以p＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　1.實驗動物基本情況
　　實驗中觀察，與對照組(NC組)大鼠相比，糖尿病模型組大鼠出現(xiàn)多食、多飲、多尿和消瘦等癥狀。整個實驗過程中有3只大鼠死亡，其中DM組死亡2只，DM+NaHS組死亡1只，最終共31只大鼠完成實驗，NC組1

7、0只，DM組10只，DM+NaHS組11只。
　　2.各組大鼠血壓、心率及代謝指標(biāo)變化
　　與NC組相比，DM組大鼠的FBG、TG、TC和FINS水平明顯升高，ISI顯著降低(p＜0.05)。與NC組相比，DM組大鼠的HR明顯上升(p＜0.05)，三組大鼠的SBP、DBP監(jiān)測未見明顯統(tǒng)計學(xué)差異。NaHS干預(yù)后能顯著改善DM大鼠的代謝異常和受損的胰島素敏感性(p＜0.05)，同時可使DM大鼠的HR顯著下降(p＜0.05)。

8、r>　　3.各組大鼠左室結(jié)構(gòu)及功能指標(biāo)的變化
　　DM組大鼠的心重/體重比值(HW/BW)較NC組顯著增加(p＜0.05)。HE染色示DM組大鼠的左室室壁增厚，心肌細胞肥大、扭曲，排列紊亂，間隙增大，細胞核大小不甚規(guī)則。Masson染色顯示:與NC組相比較，DM組大鼠的心肌間質(zhì)膠原沉積顯著增加，膠原纖維排列紊亂。與DM組相比，NaHS干預(yù)后可顯著降低HW/BW、心肌膠原纖維容積分數(shù)(CVF)，差異均具有顯著性(p＜0.05)。

9、r>　　超聲心動圖檢測提示，與NC組相比，DM組大鼠在實驗?zāi)┍憩F(xiàn)為E/A顯著降低(p＜0.05)，而EDT、IVRT顯著升高(p＜0.05)，LVEF、FS變化無統(tǒng)計學(xué)差異(p＞0.05)，提示出現(xiàn)了左室舒張功能障礙，而收縮功能正常。NaHS干預(yù)后可顯著改善糖尿病大鼠的左室舒張功能，表現(xiàn)為E/A較DM組顯著升高(p＜0.05)，而EDT、IVRT顯著降低(p＜0.05)。
　　4.凋亡水平在各組大鼠心肌組織的變化
　　TUN

10、EL染色結(jié)果顯示:與NC組大鼠相比，DM組大鼠心肌細胞的凋亡率顯著增加(p＜0.05);與DM組大鼠相比，NaHS干預(yù)組大鼠心肌細胞凋亡率顯著降低(p＜0.05)。Western blot示:與NC組相比，DM組大鼠心肌組織中Bax的表達顯著增加(p＜0.05)，而Bcl-2蛋白的表達顯著降低(p＜0.05)，提示凋亡水平增加，而經(jīng)NaHS干預(yù)后可下調(diào)Bax表達同時上調(diào)和Bcl-2的蛋白表達，差異均具有顯著性(p＜0.05)。
　

11、　5.自噬相關(guān)因子在各組大鼠心肌組織的表達
　　免疫組化染色顯示（圖5A），DM組大鼠較NC組相比，自噬相關(guān)蛋白Atg5在心肌組織內(nèi)的表達明顯降低，NaHS干預(yù)后Atg5的表達較DM組增加。Westernblot檢測顯示，與NC組相比，DM組大鼠心肌組織中自噬相關(guān)蛋白Atg5和LC3-Ⅱ/Ⅰ的表達水平顯著降低(p＜0.05)。而經(jīng)NaHS干預(yù)后可明顯上調(diào)DM大鼠心肌組織中Atg5和LC3-Ⅱ/Ⅰ的蛋白表達水平(p＜0.05)。

12、r>　　結(jié)論：
　　1.通過高糖高脂喂養(yǎng)+腹腔注射STZ，成功建立了大鼠DCM模型，為DCM發(fā)病機制的研究提供了可靠的平臺;
　　2.在2型DCM早期，心肌內(nèi)自噬水平被明顯抑制，同時伴有左室重構(gòu)及舒張功能減退;
　　3.外源性H2S可改善DCM大鼠左室重構(gòu)及功能障礙，其心肌保護作用與上調(diào)心肌細胞自噬、抑制凋亡有關(guān)。
　　第二部分：自噬在硫化氫對高糖誘導(dǎo)的心肌損傷的保護作用中的機制研究
　　目的：
　　

13、1.驗證高糖誘導(dǎo)的人AC16心肌細胞的毒性作用;
　　2.明確H2S對高糖誘導(dǎo)的人AC16心肌細胞毒性的保護作用;
　　3.體外探討自噬在H2S對高糖誘導(dǎo)的心肌細胞毒性的保護作用中的機制。
　　方法：
　　1.細胞培養(yǎng)
　　以AC16人心肌細胞系為研究對象，以5.5mmol/L的正常糖培養(yǎng)基作為正常對照(control)，采用不同濃度的高糖（11 mmol/L、22mmol/L、33mmol/L、44mmo

14、l/L）作為刺激體外模擬糖尿病狀態(tài)，觀察不同濃度高糖對心肌細胞活性的影響。
　　2.體外分組干預(yù)
　　分別觀察經(jīng)NaHS、Baf（自噬抑制劑）以及NaHS+Baf同時處理后對高糖誘導(dǎo)的心肌細胞活性的影響。細胞分組干預(yù)如下:Control組、HG組、HG+NaHS組、Control+ NaHS組、HG+ NaHS+Baf組、control+Baf組。
　　3.心肌細胞活力及損傷程度測定
　　(1)采用Countin

15、g Kit-8（CCK-8）法檢測心肌細胞活力。計算不同刺激條件下心肌細胞存活率（細胞存活率是用存活細胞與對照組相比的百分比計算）。
　　(2)用乳酸脫氫酶(LDH)釋放法檢測試劑盒檢測不同刺激條件下細胞培養(yǎng)上清中LDH水平可評價細胞損傷和細胞毒性的程度。
　　4.心肌細胞凋亡測定
　　(1)用Hoechst33258染色檢測細胞凋亡，用熒光顯微鏡觀察凋亡細胞的形態(tài)。
　　(2)通過酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測

16、定Caspase-3活性。
　　5.Western blot檢測
　　收集各組細胞并提取細胞蛋白，利用Western blot技術(shù)檢測Bax、Bcl-2、LC3、Beclin-1，p62和β-actin的蛋白表達水平。
　　6.統(tǒng)計學(xué)分析
　　數(shù)值變量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準差（Mean±SD）表示，多組間差異顯著性比較應(yīng)用One-Way ANOVA方差分析法，組間兩兩比較采用LSD，所有數(shù)據(jù)用SPSS17.0統(tǒng)計軟

17、件進行分析，以p＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　1.高糖刺激降低AC16心肌細胞活性
　　CCK-8檢測結(jié)果顯示，與正常對照組相比，在經(jīng)33mM和44mM的高濃度葡萄糖刺激24 h后AC16心肌細胞顯著降低了細胞生存能力(p＜0.05)，而低濃度的葡萄糖（11mM和22mM）刺激對細胞生存能力沒有影響(p＞0.05)。同時發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，經(jīng)22mM、33mM和44mM的高濃度葡萄糖刺激后，細胞培養(yǎng)

18、上清液中的LDH水平顯著增加(p＜0.05)。
　　2.高糖刺激可誘導(dǎo)AC16心肌細胞凋亡
　　Hoechst33258染色檢測結(jié)果顯示，與正常對照組和低濃度葡萄糖組相比，33mM和44mM的高糖刺激24小時后，AC16心肌細胞可明顯地表現(xiàn)出核碎裂和核固縮現(xiàn)象。與此同時還發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，高糖濃度在22、33和44mM時，可顯著增加Caspase-3的活性(p＜0.05)。此外，Western blot結(jié)果顯示，在33和4

19、4mM高糖刺激AC16心肌細胞后，較對照組可顯著上調(diào)Bax蛋白表達(p＜0.01)和下調(diào)Bcl-2蛋白的表達(p＜0.01)。
　　3.高糖刺激抑制AC16心肌細胞自噬
　　Western Blot檢測結(jié)果顯示，與正常對照組比較，高糖(22mM、33mM和44mM)刺激AC16心肌細胞24h后可成濃度依賴性降低Beclin-1和LC3-Ⅱ/Ⅰ的表達水平(p＜0.05)，而P62蛋白水平被明顯上調(diào)(p＜0.05)。上述差異在3

20、3mM和44mM的高糖組更加具有顯著性(p＜0.01)。
　　4.硫氫化鈉(NaHS)預(yù)處理可減輕高糖引起的心肌細胞損傷
　　在用33mM的高糖刺激AC16心肌細胞24小時前，分別用200μM和400μM的NaHS預(yù)處理30分鐘，測定細胞存活和凋亡。CCK-8法檢測結(jié)果表明，NaHS(200和400μM)預(yù)處理后明顯減弱了HG誘導(dǎo)的細胞活力下降(p＜0.05)。另外，Hoechst33258染色結(jié)果顯示，NaHS預(yù)處理后較單

21、純HG組改善了AC16心肌細胞的核固縮和核碎裂現(xiàn)象。NaHS呈濃度依賴性的逆轉(zhuǎn)了HG誘導(dǎo)的Caspase-3活性和Bax蛋白水平上調(diào)以及Bcl-2蛋白水平下調(diào)，上述結(jié)果在400μM的NaHS干預(yù)組較HG組均具有顯著性差異(p＜0.05)。
　　5.NaHS可逆轉(zhuǎn)高糖刺激對心肌細胞自噬的抑制作用
　　Western Blot檢測顯示，HG(33 mM)誘導(dǎo)后下調(diào)的Beclin-1和LC3-Ⅱ/Ⅰ水平在分別經(jīng)200μM和400μ

22、M的NaHS預(yù)處理后被明顯的逆轉(zhuǎn)，其中NaHS(400μM)干預(yù)組較HG組具有顯著性差異(p＜0.05)。同時，NaHS還呈濃度依賴性的減少AC16心肌細胞中HG誘導(dǎo)的p62蛋白水平的增加，上述差異在NaHS(200μM)干預(yù)組(p＜0.05)和NaHS(400μM)干預(yù)組(p＜0.01)均具有顯著性。
　　6.抑制自噬減弱了NaHS對高糖誘導(dǎo)的心肌細胞毒性的保護作用
　　為進一步評價自噬對于H2S在心肌細胞保護中的作用，A

23、C16細胞在HG和NaHS處理的前提下同時予以自噬抑制劑Bafilomycin A1(Baf)預(yù)處理30分鐘。CCK-8檢測結(jié)果顯示，HG+ NaHS+Baf組較HG+NaHS相比，AC16心肌細胞的生存能力顯著降低(p＜0.05); Hoechst33258染色結(jié)果顯示，NaHS預(yù)處理后挽救的HG刺激引起的細胞形態(tài)學(xué)改變被Baf干預(yù)后抵消。同時，HG+ NaHS+Baf組與HG+NaHS相比，Bax蛋白水平明顯升高(p＜0.05)，C

24、aspase-3活性顯著升高(p＜0.01)，而Bcl-2蛋白水平顯著下調(diào)(p＜0.01)，上述差異均具有顯著性。
　　結(jié)論：
　　1.高糖刺激可誘導(dǎo)AC16心肌細胞的損傷;
　　2.心肌細胞自噬水平的降低與凋亡的增加參與了高糖誘導(dǎo)的心肌損傷;
　　3.外源性H2S可減輕高糖引起的心肌細胞損傷，逆轉(zhuǎn)抑制的心肌細胞自噬;
　　4.自噬抑制劑Bafilomycin A1抵消了外源性H2S介導(dǎo)的HG刺激對心肌細胞