丁基苯酞抗大鼠大腦皮質神經元氧糖剝奪-復氧炎性損傷及機制.pdf

1、背景：缺血性腦血管病是嚴重威脅人們生命健康的常見病、多發(fā)病。雖然，國內外對該病所作的大量實驗和臨床研究，使人們對腦缺血損害及藥物干預等的認識不斷深化，針對該病的不同病理環(huán)節(jié)進行有目的、分階段、聯(lián)合治療使其預后也有了較大改觀，但該病的治療仍未取得理想效果。因此，尋找新的、針對性的治療靶點和策略很有必要。 目前，對缺血性/再灌注損傷機制的研究主要集中在氧自由基、線粒體損傷、細胞內鈣超載、興奮性氨基酸、炎癥反應和細胞凋亡等方面。其中，

2、缺血/再灌注后的炎癥反應是研究的熱點。神經元是神經系統(tǒng)的形態(tài)和功能單位，具有感受體內、外刺激傳導沖動和整合信息的能力。神經元數(shù)量龐大，約有10<'11>個，它們通過突觸彼此連接，形成復雜的神經網絡和通路。腦的不同部位和不同的細胞對缺氧的敏感性不盡相同。各類細胞對缺氧敏感性由高到低依次為：神經元、星型膠質細胞、少突膠質細胞、內皮細胞。腦缺血、腦損傷等多種神經疾病均涉及到神經元的損傷，尤其在腦缺血時，在缺血中心區(qū)和半影區(qū)存在大量的神經元變性

3、、死亡。神經元作為神經功能的主要承載者和體現(xiàn)者，保護其結構和功能是十分重要的。眾多試驗表明，腦缺血后ICAM-1、iNOS的表達增強。同時發(fā)現(xiàn)，在腦血管疾病尤腦缺血時可引起NF-κB的活化，活化的NF-κB可上調細胞因子、粘附分子、炎性蛋白酶等的表達，造成缺血腦組織的炎性反應加劇，細胞的通透性增高，細胞基質破壞，血腦屏障破壞等最終導致神經元壞死。多數(shù)學者認為NF-κB是炎癥反應的中心環(huán)節(jié)。靶向NF-κB的抗炎治療成為國內外學者的研究熱點

4、。恩必普 (通用名丁基苯酞軟膠囊，NBP)是我國研發(fā)的治療腦血管疾病的一類新藥。恩必普的主要成分丁基苯酞是從我國南方的一種水芹籽中提取出來的有效成分，可分為左旋丁基苯酞(1-NBP)、右旋丁基苯酞(d-NBP)及消旋丁基苯酞(dl-NBP)，有全新的作用機理，可以增加缺血區(qū)的腦血流，重建缺血區(qū)微循環(huán)，縮小腦梗塞面積，保護線粒體，改善腦缺血后能量代謝，減輕局部腦缺血所致的腦水腫等。有研究提示丁基苯酞可以明顯降低缺血再灌時腦損傷區(qū)的中性粒細

5、胞數(shù)目，并可以抑制缺血區(qū)的細胞間黏附分子-1(ICAM-1)和腫瘤壞死因子(TNF-α)表達的升高，d-NBP還可以降低低氧/復氧、IL-1所致的中性粒細胞-內皮細胞粘附，1-NBP能夠明顯抑制iNOS表達和NO的合成。丁基苯酞(NBP)是否可以通過抑制NF-κB的活化，進而影響其靶基因的轉錄抑制ICAM-1和iNOS蛋白的表達發(fā)揮抗炎作用而保護神經元，是我們研究的重點。 目的： (1)探討大鼠大腦皮質神經元的培養(yǎng)方法并

6、對之進行形態(tài)學觀察； (2)建立一種方便、穩(wěn)定、可靠的體外細胞氧糖剝奪(oxygenglucose deprivation，OGD)/復氧(reoxygenation)模型。 (3)通過該模型，研究神經元在氧糖剝奪/復氧后NF-κB p65的表達、活化的動態(tài)規(guī)律； (4)研究NBP對神經元在該模型條件下細胞間粘附分子-1(ICAM-1)和誘生型一氧化氮合酶(iNOS)蛋白表達的影響。 方法：取Wistar

7、大鼠乳鼠腦組織，采用篩網過濾、胰酶酶消化、離心等技術獲取大腦皮質神經元并進行培養(yǎng)，通過倒置顯微鏡、免疫細胞化學進一步鑒定，采用細胞培養(yǎng)、MTT法、酶學檢查、光學顯微鏡等研究和評價氧糖剝奪模型；采用MTT法、酶學檢查觀察丁基苯酞的保護作用；采用免疫細胞化學和RT-PCR方法研究NF-κB的動態(tài)變化及丁基苯酞對其靶基因蛋白ICAM-1、iNOS表達的影響。 結果： (1)經形態(tài)學、免疫細胞化學(NSE)鑒定所培養(yǎng)的細胞為神經

8、元； (2)OGD前后細胞形態(tài)結構變化顯著，MTT法及乳酸脫氫酶的釋放量測定均提示神經元損傷隨氧糖剝奪時間呈時間依賴關系，與正常對照組有顯著差異(P<0.05)； (3)免疫細胞化學顯示神經元的NF-κB p65蛋白表達在OGD4h時開始明顯增加(P<0.05)；R4h、R8h逐漸增加，R8h時達到高峰(P<0.05)；R12h時有所下降，但仍高于正常組(P<0.05)；R24h時進一步下降，稍高于正常組，與正常組無顯著

9、性差異(P>0.05)。NF-κB核轉位細胞R8h達到高峰，與正常對照組有顯著差異(P<0.05)，且各組間(R4h、R8h、R12h、R24h)差異顯著(P<0.05)。OGD/R前NF-κBp65大多數(shù)集中于胞漿，細胞呈“空泡”現(xiàn)象，OGD/R后NF-κBp65大多數(shù)集中于胞核，細胞呈“實心”現(xiàn)象； (4)MTT法和LDH釋放測定發(fā)現(xiàn)在OGD4h/R8h時丁基苯酞各濃度組可增加神經元的細胞活力和減少神經元LDH的釋放(P<0

10、.05)； (5)免疫細胞化學及RT-PCR檢測到在OGD4h/R8h時丁基苯酞各濃度組可顯著降低神經元表達ICAM-1、iNOS(P<0.05)； (6)不同劑量丁基苯酞(100μmol/l、10μmol/l、1μmol/l、0.1μmol/l)在增加細胞活力、減少LDH的釋放及降低神經元表達ICAM-1、iNOS等方面，高濃度組與低濃度組有統(tǒng)計學差異(P<0.05)，且丁基苯酞100μmol/l組與PDTC 100μ

11、mol/l組有統(tǒng)計學差異(P<0.05)。 結論： (1)成功培養(yǎng)出數(shù)量多、純度高的神經元； (2)建立了一種簡便、穩(wěn)定和可靠的體外大腦皮質神經元氧糖剝奪/復氧模型； (3)氧糖剝奪導致神經元NF-κB的快速活化，NF-κBp65蛋白表達在氧糖剝奪4h到復氧24h逐漸升高，復氧8h核轉位率最大(P<0.05)； (4)MTT法和LDH釋放測定發(fā)現(xiàn)在OGD4h/R8h時丁基苯酞對神經元有保護作用。

12、 (5)丁基苯酞各濃度組均可抑制NF-κB的活化，可能通過影響其靶基因的轉錄而抑制ICAM-1和iNOS蛋白的表達，從而有效保護氧糖剝奪/復氧中損傷的大腦皮質神經元。 (6)丁基苯酞各濃度組間在增加細胞活力、減少LDH的釋放及降低神經元表達ICAM-1、iNOS等方面，高濃度組與低濃度組有統(tǒng)計學差異(P<0.05)，說明高濃度組比低濃度組更能發(fā)揮保護作用，且丁基苯酞100μmnol/l組與PDTC 100μmol/l組有統(tǒng)