工頻磁場對胎鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)元的影響.pdf

1、研究目的： 隨著電力事業(yè)的飛速發(fā)展和各種電器設(shè)備的廣泛應(yīng)用，人們生活空間中所接觸到的工頻磁場輻射日益增多。許多研究表明工頻磁場是危害性非常大的污染源，嚴(yán)重影響人體健康。因此，工頻磁場的生物效應(yīng)便成為生物電磁學(xué)領(lǐng)域的一個重要課題。 在人體各系統(tǒng)中，中樞神經(jīng)系統(tǒng)是對電磁輻射最敏感的系統(tǒng)，神經(jīng)元是神經(jīng)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)和功能的基本單位，要深入探討工頻磁場對神經(jīng)系統(tǒng)的生物學(xué)作用，就必須開展工頻磁場對神經(jīng)元作用的研究。工頻磁場對神經(jīng)元的

2、生物學(xué)效應(yīng)是磁場和神經(jīng)元共同作用的結(jié)果，是與兩者的參數(shù)密切相連的。工頻磁場的強(qiáng)度、作用時間，接受磁場作用的神經(jīng)元的來源、部位、生長狀態(tài)等參數(shù)都是影響工頻磁場生物學(xué)效應(yīng)的主要因素。 本課題對體外培養(yǎng)胎鼠皮質(zhì)神經(jīng)元施加工頻磁場輻射，旨在探討工頻磁場(50-60Hz)對胎鼠皮質(zhì)神經(jīng)元的損傷效應(yīng)，并綜合分析其可能機(jī)制。 研究方法： 以Wistar孕大鼠13.5～14d的胚胎原代培養(yǎng)的大腦皮質(zhì)神經(jīng)元為實驗材料。神經(jīng)元

3、培養(yǎng)48h后，隨機(jī)分為對照組和實驗組，對實驗組神經(jīng)元施加工頻磁場輻射，主要參數(shù)選擇：重復(fù)頻率50Hz、平均場強(qiáng)0.3mT，30min/次，3次/d，共2d。輻射完畢12h后，分別對對照組和實驗組神經(jīng)元進(jìn)行以下檢測： 1.細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察： (1)倒置顯微鏡觀察：在倒置顯微鏡下觀察神經(jīng)元的生長情況。 (2)透射電子顯微鏡觀察：輻射完畢12h后，3％戊二醛預(yù)固定10min，用細(xì)胞刮刮下細(xì)胞并轉(zhuǎn)移到離心管中，經(jīng)離心

4、、固定、脫水、包埋、切片、染色等處理，JEM-1200EX型透射電子顯微鏡觀察記錄。 (3)掃描電子顯微鏡觀察：將細(xì)胞接種于預(yù)置蓋玻片的培養(yǎng)板中，輻射完畢12h后，2.5％戊二醛前固定，用0.1mol/L磷酸緩沖液沖洗數(shù)次，1％鋨酸后固定，再用乙醇梯度脫水，醋酸異戊酯置換，二氧化碳臨界干燥，高真空蒸發(fā)儀噴鍍，掃描電子顯微鏡觀察記錄。 2.相對存活率測定：四甲基偶氮噻唑藍(lán)比色法(MTT)測定實驗組神經(jīng)元的相對存活率。

5、 3.細(xì)胞死亡的檢測：采用H033342、PI熒光雙染的方法觀察對照組和實驗組的細(xì)胞死亡情況。 4.流式細(xì)胞術(shù)測定神經(jīng)元胞漿內(nèi)游離Ca2+濃度的變化：收集細(xì)胞，加Fluo3/AM至終濃度為10μmol/L，避光孵育1h。利用流式細(xì)胞儀檢測(激發(fā)波長為506nm，發(fā)射波長為526nm)，取10000個神經(jīng)元熒光強(qiáng)度值的平均值為各組測定值。 5.流式細(xì)胞術(shù)測定線粒體膜電位：收集細(xì)胞，加羅丹明123至終濃度為10μ

6、g/ml，孵育30min。利用流式細(xì)胞儀檢測(激發(fā)波長為488nm，發(fā)射波長為530nm)，取10000個神經(jīng)元熒光強(qiáng)度值的平均值為各組測定值。 6.脂質(zhì)過氧化測定：輻射完畢12小時后收集細(xì)胞(106個)；超聲波破碎細(xì)胞；4℃超速離心機(jī)12000rpm/m離心15分鐘后取上清；依試劑盒說明書進(jìn)行各步驟反應(yīng)；721分光光度儀分別測定各組細(xì)胞內(nèi)MDA含量和SOD活性。 結(jié)果： 1.細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察： (

7、1)倒置顯微鏡觀察：對照組神經(jīng)元24h后絕大多數(shù)已貼壁，分散均勻；有的神經(jīng)元伸出長短不等的突起，少數(shù)神經(jīng)元之間己建立突起聯(lián)系。培養(yǎng)48h后，神經(jīng)元之間已建立廣泛的突起聯(lián)系。96h后神經(jīng)元胞體飽滿，立體感強(qiáng)，神經(jīng)元的突起表面平滑。實驗組神經(jīng)元生長狀態(tài)欠佳，胞體欠飽滿，神經(jīng)元之間也有突起聯(lián)系，但是突起表面粗糙，與對照組神經(jīng)元的形態(tài)有明顯差異。 (2)透射電子顯微鏡觀察：對照組神經(jīng)元常染色質(zhì)豐富；胞漿中線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基復(fù)合體豐

8、富，胞漿及突起內(nèi)富含微管、微絲。實驗組神經(jīng)元胞漿內(nèi)部分線粒體嵴排列紊亂，偶見巨大線粒體；大量神經(jīng)元胞漿中自噬體和殘余溶酶體明顯增多，有的甚至充滿細(xì)胞漿，高倍下可見這些小體由單層膜或雙層膜包繞，呈高電子密度；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張，腔內(nèi)潴留物增多，高爾基復(fù)合體欠發(fā)達(dá)。 (3)掃描電子顯微鏡觀察：對照組神經(jīng)元有大量的長短不一的突起，伸出的突起與臨近細(xì)胞的突起相連，胞體及突起表面光滑。實驗組與對照組相比細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯的變化，細(xì)胞突起收縮、斷裂

9、，胞間連接斷裂，胞體及突起欠光滑，其表面有較多毛刺狀突起，胞質(zhì)中可見較多顆粒。 2.細(xì)胞死亡的檢測： Ho33342和PI雙標(biāo)：對照組中的細(xì)胞核質(zhì)均勻，呈現(xiàn)藍(lán)色熒光；磁場照射組出現(xiàn)呈紅色熒光的壞死細(xì)胞，部分細(xì)胞出現(xiàn)染色質(zhì)凝集、邊緣化現(xiàn)象。 3.相對存活率測定：對照組和實驗組神經(jīng)元光密度(A570)值分別為0.515±0.029和0.398±0.016。 4.神經(jīng)元胞漿內(nèi)游離Ca2+濃度的測定：對照

10、組和實驗組神經(jīng)元胞漿內(nèi)游離Ca2+平均熒光強(qiáng)度分別為91.23-4-1.16和88.424-2.08。 5.線粒體膜電位測定：對照組和實驗組神經(jīng)元線粒體膜電位平均熒光強(qiáng)度分別為63.344±1.55和44.364±1.73。 6.脂質(zhì)過氧化測定：對照組和實驗組神經(jīng)元MDA含量分別為13.244±0.36和18.67±0.45；對照組和實驗組神經(jīng)元SOD活性分別為32.984±1.35和17.74±0.96。

11、 結(jié)論： 本實驗條件下，工頻磁場(重復(fù)頻率50Hz、平均場強(qiáng)0.3mT)可導(dǎo)致體外培養(yǎng)的胎鼠皮質(zhì)神經(jīng)元的形態(tài)發(fā)生明顯變化，并可抑制其生長，造成其代謝異常、線粒體膜電位降低、MDA含量升高和SOD活性降低。胞漿內(nèi)游離Ca2+濃度基本無變化，可能是與輻射時間的長短、輻射次數(shù)及輻射完畢與收集細(xì)胞之間的時間間隔有關(guān)。因此，探討工頻磁場的生物學(xué)效應(yīng)需要綜合分析多項指標(biāo)，并應(yīng)深入考慮。 意義： 本課題選擇工頻磁場(50