高溫對小鼠大腦皮質神經元骨架蛋白和熱休克蛋白70表達的影響.pdf

1、隨著全球氣候的變暖，高溫導致的神經系統(tǒng)功能紊亂越來越多見。熱應激環(huán)境下，當人體維持熱平衡的汗液蒸發(fā)降溫超過環(huán)境中的最大蒸發(fā)量時，體內熱量蓄積，下丘腦調節(jié)熱蓄積和熱消散平衡失敗，人體的熱平衡被破壞，體核溫度持續(xù)升高，導致中暑高熱、虛脫。軍隊的日常訓練及實戰(zhàn)常處在高溫環(huán)境中，某些特殊兵種(如坦克兵、防化兵)要長期在高溫環(huán)境下生活、工作。此外，由于疾病導致體溫過高或持續(xù)時間過長的發(fā)熱等情況的存在，致使中署、熱痙攣、熱衰竭等疾病更易發(fā)生，出現(xiàn)頭

2、痛、驚厥、昏迷等癥狀。因此，研究高溫應激對中樞神經系統(tǒng)損害機制，從而研制和開發(fā)出各種保護技術和設備，就具有重要的軍事意義和應用價值。 從低等動物細菌到高等動物人類，受高溫作用后均可發(fā)生熱應激反應，此反應的特點是選擇性合成一組多肽——熱休克蛋白(HSPs)，它是一種保護機體的蛋白，由細胞核內高度保守的熱應激基因編碼的產物。HSPs一般按照其相對分子質量的大小進行分類，其中HSP70在熱應激中升高最顯著，作用也最大。 盡管存

3、在爭議，多項研究表明高溫可導致不同程度的腦損傷，而神經元的細胞骨架結構改變則被認為是最終導致神經細胞死亡的微觀基礎。細胞骨架按纖維直徑的大小可分為微管、微絲、中間纖維以及纖維網。微絲是由α-tubulin和β-tubulin異二構體形成的原微絲構成，是神經元骨架蛋白重要的組成部分。細胞骨架的完整性對維持神經系統(tǒng)正常生理功能具有至關重要的作用。 因此詳細了解熱應激對神經細胞的損傷機制，以及HSPs在此過程中的作用，可以為尋找熱應激

4、損傷神經系統(tǒng)的保護性方法和技術提供有益的思路。目前的研究表明高溫可導致神經系統(tǒng)發(fā)育畸形，記憶力下降，而在體外培養(yǎng)的神經元上，這方面的報道較少。本研究旨在體外培養(yǎng)神經元高溫損傷模型的基礎上，探討高溫損傷后神經元的形態(tài)、骨架蛋白及HSP70的改變，初步探討HSP70的神經元保護作用，希望能為高溫導致神經系統(tǒng)損傷的機制及治療做一些有益的基礎工作。 本實驗在建立的小鼠大腦皮質神經元高溫損傷模型基礎上，將培養(yǎng)的皮質神經元分為未經高溫處理的

5、對照組、高溫處理的實驗組，采用倒置顯微鏡、免疫熒光雙標記法結合激光共聚焦掃描等方法，觀察對照組及處理組各溫度下?lián)p傷的神經元的形態(tài)學、骨架蛋白β-tubulin和HSP70的表達變化。本次實驗所得結果如下： [1]光鏡觀察：在倒置顯微鏡下，正常神經細胞經胰蛋白酶消化后呈圓形。接種培養(yǎng)后10h，胞體增大呈圓形或橢圓形，分散的神經細胞開始貼壁。24h后大部分神經細胞貼壁，突起延長，開始相互連接。7d后細胞光暈明顯，胞體飽滿并聚集成團，

6、細胞團間有粗大的突起并相互連接，神經網絡稠密。處理組高溫后漂浮細胞增加，神經細胞數(shù)目減少，神經網絡稀疏，有的細胞突起漂浮，有的失去突起，呈圓形或橢圓形。這種形態(tài)改變溫度越高越明顯。 [2]激光共聚焦顯微鏡觀察：高溫處理組38、39、40、41、42℃熱刺激后β-tubulin熒光強度低于正常對照組，且溫度愈高，降低愈明顯。HSP70熒光強度呈鐘形分布，39℃最高，37℃、42℃最低。高溫時間組39℃刺激后不同恢復時間點(0，2，

7、6，24，72h)神經元β-tubulin熒光強度均低于對照組，且隨恢復時間延長β-tubulin熒光強度值逐漸升高。高溫時間組39℃刺激后不同恢復時間點(0，2，6，24，72h)HSP70熒光強度均高于對照組。且隨恢復時間的延長HSP70熒光強度值先升高后降低，于2h時達高峰，24h仍維持在較高的水平。 [3]熒光顯微鏡觀察：高溫時間組39℃刺激后，HSP70蛋白由細胞漿轉移至細胞核內聚集，停止刺激后再逐漸轉移回細胞漿中。

8、 本次實驗結論如下： [1]高溫刺激會導致神經元形態(tài)和軸突發(fā)生變化，出現(xiàn)神經元凋亡或死亡，溫度越高損傷越嚴重。 [2]神經元熱損傷中骨架蛋白β-tubulin發(fā)生了變化，可能發(fā)生了蛋白的解聚、錯折疊，部分可能發(fā)生了變性。但隨著恢復時間的延長，這些骨架蛋白又重新聚合、正確折疊，變性的蛋白降解。 [3]體外培養(yǎng)的神經元在正常溫度和高溫環(huán)境中均有HSP70表達。高溫刺激后HSP70的表達明顯高于正常溫度。這可能是