替米沙坦對骨骼肌糖代謝的影響及機(jī)制研究.pdf

1、背景和目的:代謝綜合征(metabolic syndrome,MS)是以中心性肥胖為核心,合并血壓、血糖、甘油三酯升高和/或高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)降低,可顯著增加2型糖尿病和心血管病的危險(xiǎn)性。一類抗高血壓藥物,血管緊張素Ⅱ受體阻斷劑(ARBs)常用于治療合并有糖尿病或糖尿病腎病的高血壓患者。幾個(gè)臨床試驗(yàn)的亞組分析發(fā)現(xiàn)這類藥物改善了患者的胰島素抵抗、降低了高血壓患者中新發(fā)糖尿病的發(fā)生率。在動(dòng)物試驗(yàn)也證實(shí)Arms改善肥胖或高血壓大

2、鼠的胰島素抵抗。由于2型糖尿病目前在全球普遍流行,ARBs的這些藥理作用值得進(jìn)一步關(guān)注,以便制定防治該病的更好策略。但是,ARBs對葡萄糖穩(wěn)態(tài)的作用還沒有完全闡明。人們廣泛認(rèn)為,ARBs潛在的抗糖尿病作用主要與它們能阻斷腎素.血管緊張素系統(tǒng)(RAS),糾正血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)對代謝的副作用有關(guān)。AngⅡ通過對胰島素信號通路、組織血流、氧化應(yīng)急、交感神經(jīng)活性和脂肪生成的作用損害葡萄糖代謝。ARBs與AngⅡ受體結(jié)合,競爭地阻斷AngⅡ

3、的作用從而發(fā)揮增加胰島素敏感性、降血糖的作用。但是,也有一些研究認(rèn)為ARBs對胰島素敏感性的作用相當(dāng)小或沒有作用。這說明ARBs可能存在獨(dú)立于RAS阻斷以外的抗糖尿病作用。
　　 在眾多的ARBs中,替米沙坦(Tel)在結(jié)構(gòu)上不同與臨床上用的其他ARBs。替米沙坦結(jié)構(gòu)類似于胰島素增敏劑比格咧酮,能部分激活過氧化物酶體增值激活受體丫(PPARγ),從而影響炭水化合物和脂代謝。然而,PPARγ主要分布于脂肪組織,肌肉組織才是外周進(jìn)行

4、葡萄糖處理的主要組織,而在肌肉組織中主要分布的PPARs為δ型。PPARδ在代謝綜合征的作用最近才開始被闡明,已有的研究表明PPARδ在調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝、改善胰島素敏感性以及抗動(dòng)脈粥樣硬化中發(fā)揮重要的作用,有望成為防治MS、2型糖尿病的新型藥物靶點(diǎn)。因此我們推論替米沙坦在肌肉組織中通過激活PPARδ發(fā)揮其增加胰島素敏感性,改善胰島素抵抗的作用。為了明確替米沙坦與PPARδ在肌肉組織是否存在相互作用及與葡萄糖代謝的關(guān)系,本研究分別于在體和離體

5、水平對上述推論進(jìn)行探討,以期為高危人群中藥物預(yù)防糖尿病發(fā)生提供理論依據(jù)。本研究分為三個(gè)部分:1.用替米沙坦急性刺激C2C12和原代培養(yǎng)的C57BL/6J和PPARδ基因敲除小鼠的骨骼肌細(xì)胞,觀察替米沙坦對不同細(xì)胞葡萄糖攝取的不同影響。2.從分子水平觀察替米沙坦對骨骼肌組織及細(xì)胞PPARδ、PPARγ、RAS組份及其它相關(guān)蛋白表達(dá)的影響,初步探討替米沙坦影響骨骼肌葡萄糖代謝的分子機(jī)制。3.用替米沙坦長期喂養(yǎng)C57BL/6J和PPARδ基因

6、敲除小鼠,觀察替米沙坦對這兩種小鼠模型體重、肌纖維組成及葡萄糖耐量等表型的不同影響。
　　 材料方法:
　　 整個(gè)研究分在體和離體實(shí)驗(yàn)兩部分。離體研究以C2C12細(xì)胞和原代培養(yǎng)的C57BL/6J(C57)和PPARδ基因敲除小鼠的骨骼肌細(xì)胞為研究對象。在體試驗(yàn)以C57和PPARδ基因敲除小鼠,以及自發(fā)性高血壓大鼠(SHR)作為模型。
　　 1.小鼠骨骼肌系C2C12細(xì)胞誘導(dǎo)成熟后分別用胰島素,胰島素+AngⅡ,胰

7、島素+AngⅡ+替米沙坦刺激,然后用3H-2脫氧葡萄糖檢測細(xì)胞對2-脫氧葡萄糖(2-DG)的攝取率。
　　 2.采用原代骨骼肌細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù),培養(yǎng)C57和PPAR6基因敲除小鼠骨骼肌細(xì)胞。細(xì)胞融合后換用無血清培養(yǎng)基,在有或無Compound C存在的情況下加用不同濃度的替米沙坦刺激24小時(shí),再用3H-2脫氧葡萄糖測其對2-DG攝取率。
　　 3.提取原代培養(yǎng)骨骼肌細(xì)胞及小鼠模型腓腸肌的總RNA和蛋白,用半定量RT-PCR技

8、術(shù)檢測PPAARγ和PPARδ mRNA表達(dá);用Western blot技術(shù)分析PPARγ、PPARδ、RAS組份(ACE、AngⅡ、Renin和AT1R)以及其它相關(guān)蛋白(AMPKα、p-AMPKα、TroponinⅠ-ss)的表達(dá)。SHR大鼠肌肉組織PPARγ、PPARδ mRNA和蛋白表達(dá)也被分析。
　　 4.用替米沙坦干預(yù)C57BL/6J和PPARδ基因敲除小鼠共24周,觀測喂養(yǎng)前10天的進(jìn)食量、飲水量;每2周觀測一次體

9、重;第23-24周時(shí)進(jìn)行運(yùn)動(dòng)耐量、氧耗量測試、腹腔內(nèi)注射葡萄糖耐量實(shí)驗(yàn)和胰島素耐量實(shí)驗(yàn);第24周過夜空腹麻醉后處死,取血測胰島素、甘油三酯和總膽固醇;取雙側(cè)腓腸肌,一側(cè)冰凍切片后做ATP染色,觀察骨骼肌纖維成分組成,另一側(cè)-70℃凍存,備提蛋白和RNA。
　　 結(jié)果:
　　 1.胰島素刺激成熟C2C12細(xì)胞的2-DG攝取,AngⅡ抑制胰島素的該作用;替米沙坦的存在則逆轉(zhuǎn)了AngⅡ?qū)σ葝u素刺激的2-DG攝取的抑制作用。

10、r>　　 2.原代培養(yǎng)的C57小鼠骨骼肌細(xì)胞在胰島素刺激下2-DG攝入增加,替米沙坦劑量依賴性增加C57骨骼肌細(xì)胞2-DG攝入,該作用在AMPK抑制劑Compound C存在時(shí)受抑制;胰島素仍能刺激原代培養(yǎng)的PPARδ基因敲除小鼠骨骼肌細(xì)胞的2-DG攝入,但替米沙坦對此骨骼肌無增加2-DG攝入的作用。
　　 3.替米沙坦急性干預(yù)顯著增加原代培養(yǎng)的C57骨骼肌細(xì)胞PPARδ mRNA和PPAR5、AMPK、p-AMPK蛋白表達(dá),

11、對PPARγ mRNA和PPARγ、RAS組份蛋白表達(dá)無影響;替米沙坦長期干預(yù)增加C57骨骼肌組織PPAR5 mRNA和PPARδ、p-AMPK蛋白表達(dá),對PPARγ mRNA和PPARγ、RAS組份蛋白表達(dá)無影響;替米沙坦長期或急性干預(yù)都不影響PPARδ基因敲除小鼠骨骼肌細(xì)胞和組織的PPARγ mRNA和PPARγ、AMPK、p-AMPK、RAS組份蛋白表達(dá)。替米沙坦長期干預(yù)促進(jìn)SHR肌肉組織PPARδ mRNA和蛋白表達(dá),也促進(jìn)肌肉

12、組織PPARγ mRNA和蛋白表達(dá)。
　　 4.替米沙坦喂養(yǎng)的小鼠與普食喂養(yǎng)的小鼠攝食量、飲水量無區(qū)別。C57小鼠替米沙坦喂養(yǎng)組較普通飲食喂養(yǎng)組的小鼠體重增加緩慢,12周以后體重明顯減輕。實(shí)驗(yàn)23-24周時(shí),血總膽固醇下降,運(yùn)動(dòng)耐量增加,運(yùn)動(dòng)后氧耗量增加,腓腸肌中Ⅰ型纖維肌肉成分增多,腹腔內(nèi)注射葡萄糖耐量曲線下面積減少,胰島素耐量實(shí)驗(yàn)中胰島素注射后血糖下降更明顯,曲線下面積明顯減少。PPARδ基因敲除小鼠替米沙坦喂養(yǎng)組和普通喂養(yǎng)

13、組之間以上觀察指標(biāo)間無顯著差異。
　　 結(jié)論:
　　 1.替米沙坦對骨骼肌細(xì)胞的葡萄糖攝取有直接促進(jìn)作用,該作用通過PPARδ/AMPK途徑發(fā)揮作用。當(dāng)RAS活性增強(qiáng)時(shí),替米沙坦還通過抑制AngⅡ作用改善胰島素刺激下的骨骼肌細(xì)胞葡萄糖攝取。
　　 2.替米沙坦通過激活PPARδ/AMPK途徑,抑制小鼠體重增加,增加腓腸肌中Ⅰ型纖維含量和運(yùn)動(dòng)后氧耗量,提高運(yùn)動(dòng)耐量,改善葡萄糖耐量,增加胰島素敏感性。