二氮嗪預(yù)處理H2O2損傷L6骨骼肌成肌細(xì)胞的作用.pdf

1、目的:缺血性心臟病是嚴(yán)重危害人類健康的疾病之一,目前的治療包括藥物治療、介入、外科手術(shù)等治療,雖然在一定程度上延緩了病程的發(fā)展,但卻不能逆轉(zhuǎn)己壞死的心肌,無(wú)法中斷心衰的進(jìn)展。細(xì)胞移植為病損心臟的細(xì)胞重建及衰竭心臟的功能恢復(fù),提供了一種嶄新的方法。研究結(jié)果表明干細(xì)胞移植能促進(jìn)心臟血管和心肌細(xì)胞的新生,改善心肌血液供應(yīng),增強(qiáng)心臟功能。在細(xì)胞移植的眾多研究中,骨骼肌成肌細(xì)胞移植因有更廣泛的臨床應(yīng)用前景更是受到科學(xué)家的青睞。骨骼肌成肌細(xì)胞存在于

2、骨骼肌肌膜和基膜之間,是骨骼肌細(xì)胞的前體細(xì)胞。骨骼肌成肌細(xì)胞作為供體細(xì)胞有很多理想的特性,如在體外未分化狀態(tài)有增殖能力,在缺血組織內(nèi)仍然能夠成活,用自體成肌細(xì)胞移植,無(wú)免疫排斥反應(yīng),可作為基因的載體等。這些優(yōu)點(diǎn)使骨骼肌成肌細(xì)胞成為心臟干細(xì)胞移植主要的干細(xì)胞種類之一。但是移植后干細(xì)胞在宿主心肌受損的微環(huán)境中存活率極低,嚴(yán)重影響細(xì)胞治療的效果。急性心梗后氧化酶與抗氧化酶的平衡被打破,活性氧化物(reactive oxygen species

3、,ROS)在心梗區(qū)和非心梗區(qū)均升高,氧化應(yīng)激持續(xù)存在。梗死心臟中增高的活性氧化物是誘導(dǎo)移植細(xì)胞凋亡的重要因素。減少缺血應(yīng)激時(shí)的細(xì)胞凋亡,提高移植細(xì)胞存活率,增強(qiáng)細(xì)胞移植的治療效果是目前急需解決的問(wèn)題。本研究采用過(guò)氧化氫(H2O2)體外誘導(dǎo)L6骨骼肌成肌細(xì)胞(L6 Skeletal Myoblast,L6SkM)損傷,建立L6SkM氧化應(yīng)激損傷模型,觀察二氮嗪(diazoxide,DZ)預(yù)處理對(duì)氧化應(yīng)激損傷L6SkM的作用,意圖尋找提高移

4、植細(xì)胞存活率、增強(qiáng)治療效果的有效方法。
　　 方法:
　　 1、不同濃度H2O2對(duì)L6SkM的作用體外培養(yǎng)L6骨骼肌成肌細(xì)胞(L6Skeletal Myoblast,L6SkM),用H2O2誘導(dǎo)L6SkM損傷。實(shí)驗(yàn)分正常對(duì)照組(normal control),H2O2損傷1-5組(H2O2 group,濃度分別為0.10、0.50、1.00、1.20、1.50mmol/L,作用時(shí)間為12小時(shí)、24小時(shí)、36小時(shí))。通過(guò)M

5、TT比色法檢測(cè)各組細(xì)胞活力,摸索誘導(dǎo)H2O2氧化損傷的適當(dāng)濃度及時(shí)間,建立L6SkMH2O2氧化應(yīng)激損傷模型。
　　 2、不同濃度DZ預(yù)處理對(duì)L6SkM的作用體外培養(yǎng)L6骨骼肌成肌細(xì)胞(L6SkM),實(shí)驗(yàn)分正常對(duì)照組(normal control),H2O2損傷組(H2O2group,1.00mmol/L,24hours),DZ預(yù)處理1-4組(DZ group):在培養(yǎng)基中先加入終濃度為50umol/L、100umol.L、20

6、0umol/L、400umol/L的二氮嗪孵育30分鐘,再換為含1.00mm01/LH2O2的培養(yǎng)基作用24小時(shí)誘導(dǎo)損傷。通過(guò)MTT比色法檢測(cè)各組細(xì)胞活力,觀察不同濃度二氮嗪預(yù)處理對(duì)過(guò)氧化氫損傷后細(xì)胞活力的影響,摸索DZ的適當(dāng)濃度,建立DZ預(yù)處理L6SkM的保護(hù)實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀?br>　　 3、DZ預(yù)處理對(duì)H2O2損傷L6SkM的作用體外培養(yǎng)L6骨骼肌成肌細(xì)胞(L6SkM)。實(shí)驗(yàn)分正常對(duì)照組(normal control),H2O2損傷組(

7、H2O2 group,1.00mmol/L,24hours),DZ預(yù)處理組(DZ group,200umol/L,30min+H2O2損傷)。MTT比色法檢測(cè)各組細(xì)胞活性:檢測(cè)各組培養(yǎng)液中乳酸脫氫酶(LDH)含量并計(jì)算LDH的釋放率,評(píng)估細(xì)胞膜損傷情況;光鏡、電鏡觀察細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化;流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定細(xì)胞凋亡率、細(xì)胞周期;免疫細(xì)胞化學(xué)染色檢測(cè)CytC、PCNA、Bcl-2、Bax的表達(dá);western-blot法檢測(cè)Bcl-2、Bax的表

8、達(dá)水平。
　　 結(jié)果:
　　 1、不同濃度H2O2對(duì)L6SkM的作用MTT檢測(cè)結(jié)果提示,隨著H2O2濃度的升高,作用時(shí)間的延長(zhǎng),細(xì)胞活力(OD值)逐漸降低,呈明顯的劑量和時(shí)間依賴性。我們選擇引起細(xì)胞活力下降45％左右的H2O2濃度(1.00mmol/L)作用24h,建立L6SkM損傷模型。
　　 2、不同濃度DZ預(yù)處理對(duì)L6SkM的作用MTT檢測(cè)結(jié)果提示,經(jīng)DZ預(yù)處理后,細(xì)胞活力(OD值)呈上升趨勢(shì)。與H2O2組

9、相比較,DZ100umol/L、200umol/L、400 umol/L濃度組細(xì)胞吸光度值(OD值)顯著上升。200umol/L與400 umol/L濃度組之間吸光度值無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,我們選擇200umol/LDZ孵育30min建立保護(hù)實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀?br>　　 3、DZ預(yù)處理對(duì)H2O2損傷L6SkM的作用
　　 3.1 MTT檢測(cè)顯示,與正常對(duì)照組比較,H2O2組的細(xì)胞活力明顯下降;與H2O2組比較,DZ組的細(xì)胞活力明顯上升;DZ

10、組與正常對(duì)照組的細(xì)胞活力相比較無(wú)明顯差異。
　　 3.2 LDH檢測(cè)顯示,與正常對(duì)照組比較,H2O2組的LDH含量明顯增高:與H2O2組比較,DZ組的LDH含量明顯降低,但仍高于正常對(duì)照組。
　　 3.3 L6SkM的形態(tài)變化,H2O2組的L6SkM收縮,部分變成圓形,核收縮變小,核質(zhì)致密濃染或呈碎塊狀致密濃染;電鏡顯示部分細(xì)胞表面出現(xiàn)較多的球狀突起及皺褶,細(xì)胞核異染色質(zhì)邊集,并逐漸凝聚成新月?tīng)罡接诤四ぶ苓?。DZ預(yù)處理可

11、明顯改善H2O2所致的L6SkM損傷表現(xiàn)。
　　 3.4流式細(xì)胞儀分析,DZ預(yù)處理可以減少H2O2誘導(dǎo)的L6SkM凋亡,促進(jìn)L6SkM增殖。
　　 3.5免疫細(xì)胞化學(xué)染色檢測(cè)顯示,與正常對(duì)照組相比,H2O2組PCNA、Bcl-2蛋白表達(dá)下降,Bax蛋白表達(dá)明顯增加;與H2O2組相比,DZ組PCNA、Bcl-2蛋白表達(dá)明顯上升,Bax蛋白表達(dá)下降。與正常對(duì)照組相比,DZ組PCNA、Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)無(wú)明顯差異。H2

12、O2組部分細(xì)胞細(xì)胞色素C的免疫反應(yīng)性明顯增強(qiáng)并呈彌漫性片狀分布,表明細(xì)胞色素C由線粒體釋放到胞質(zhì);DZ組與正常對(duì)照組細(xì)胞胞漿中棕黃色顆粒分布均勻,染色淺,表明細(xì)胞色素C存在于線粒體中。
　　 3.6 Western-blot法檢測(cè)顯示,H2O2組Bcl-2蛋白表達(dá)明顯低于正常對(duì)照組,而B(niǎo)ax蛋白表達(dá)明顯高于正常對(duì)照組;DZ組Bcl-2蛋白表達(dá)明顯高于H2O2組,Bax蛋白表達(dá)明顯低于H2O2組;DZ組Bcl-2蛋白表達(dá)上升,但還

13、是低于正常對(duì)照組,兩組存在差異,而B(niǎo)ax蛋白表達(dá),兩組間無(wú)差異。
　　 結(jié)論:
　　 1、H2O2可誘導(dǎo)L6SkM損傷,并且具有濃度和時(shí)間依賴性。我們選擇使細(xì)胞活力下降45％左右的1mmol/L H2O2,作用L6SKM24小時(shí)為適合本實(shí)驗(yàn)研究的最佳條件。
　　 2、二氮嗪預(yù)處理對(duì)氧化應(yīng)激損傷L6SkM具有保護(hù)作用,其可以維持細(xì)胞膜、線粒體膜的完整,防止細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變,促進(jìn)增殖,抑制凋亡,從而減輕氧化應(yīng)激損