RNAi對(duì)成肌細(xì)胞系L6中FOXO3a基因表達(dá)的影響.pdf

1、目的
　　通過(guò)探討RNAi技術(shù)體外抑制FOXO3a基因表達(dá)的效果，從而為RNAi介導(dǎo)的失神經(jīng)骨骼肌萎縮基因治療奠定基礎(chǔ)。
　　方法
　　訂購(gòu)FOXO3a基因的siRNA重組質(zhì)粒，培養(yǎng)大鼠成肌細(xì)胞系L6，將FOXO3asiRNA重組質(zhì)粒在Lipofectamine2000介導(dǎo)下轉(zhuǎn)染，熒光倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)，于轉(zhuǎn)染后48h與72h，采用實(shí)時(shí)定量PCR和Westernblot檢測(cè)siRNA重組質(zhì)粒對(duì)FOXO3a的m

2、RNA和蛋白質(zhì)水平的抑制效果。
　　結(jié)果
　　1、轉(zhuǎn)染后24h，熒光倒置顯微鏡下觀察到細(xì)胞中有綠色熒光表達(dá)，表明成功將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到大鼠成肌細(xì)胞系L6中。
　　2、實(shí)時(shí)定量PCR分析結(jié)果顯示：各干擾序列FOXO3a-Ⅰ、FOXO3a-Ⅱ、FOXO3a-Ⅲ、FOXO3a-Ⅳ在轉(zhuǎn)染后48h對(duì)FOXO3a的mRNA的抑制率分別為54％、25％、22％、27％，在mRNA水平均明顯抑制了FOXO3a的表達(dá)；各干擾序列FOXO3a-

3、Ⅰ、FOXO3a-Ⅱ、FOXO3a-Ⅲ、FOXO3a-Ⅳ轉(zhuǎn)染后72h對(duì)FOXO3a的mRNA的抑制率分別為81％、52％、46％、55％，抑制效應(yīng)更為明顯，抑制效果最為明顯的是FOXO3a-Ⅰ。
　　3、Western印跡灰度分析結(jié)果顯示：各干擾序列FOXO3a-Ⅰ、FOXO3a-Ⅱ、FOXO3a-Ⅲ、FOXO3a-Ⅳ在轉(zhuǎn)染后48h對(duì)FOXO3a蛋白表達(dá)的抑制率分別為46％、12％、11％、23％，明顯抑制了FOXO3a的表達(dá)；各

4、干擾序列FOXO3a-Ⅰ、FOXO3a-Ⅱ、FOXO3a-Ⅲ、FOXO3a-Ⅳ在轉(zhuǎn)染后72h對(duì)FOXO3a蛋白表達(dá)的抑制率分別為72％、48％、38％、44％，抑制效應(yīng)更為明顯，與mRNA水平的影響一致。
　　結(jié)論
　　1、RNA干擾技術(shù)在體外能夠明顯抑制叉頭蛋白轉(zhuǎn)錄因子FOXO3a基因的表達(dá)。
　　2、活體實(shí)驗(yàn)中FOXO3a基因siRNA重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染其干擾序列對(duì)FOXO3a的mRNA和蛋白抑制效果尚不明確，這為RNA