雪旺氏細胞共培養(yǎng)對成肌細胞基因表達譜的影響.pdf

1、隨著骨骼肌相關疾病如骨骼肌損傷，肌營養(yǎng)不良，肌萎縮和肌肥大等的發(fā)病率越來越高，有關骨骼肌損傷后修復、再生和重建的細胞和分子水平的機制研究日益受到研究者的高度關注。應用組織工程學原理和技術方法研究復合型的骨骼肌重建，進而修復肌損傷，是一種創(chuàng)新的研究。 成肌細胞（Myoblast）由骨骼肌衛(wèi)星細胞（Skeletal satellitecell）分化而來，來源于胚胎的中胚層細胞，在胚胎的發(fā)育過程中不斷增殖、分化為成熟的骨骼肌組織，成肌

2、干細胞以肌衛(wèi)星細胞形式存在于肌纖維的肌膜和基底膜之間。生理狀態(tài)下，肌衛(wèi)星細胞以靜止未分化狀態(tài)存在，骨骼肌受到損傷時肌纖維開始壞死，巨噬細胞吞噬壞死細胞和肌纖維基底膜，此時肌衛(wèi)星細胞激活分裂為紡錘形的成肌細胞，相互融合為肌管，發(fā)育形成再生肌纖維。雪旺細胞（schwann cells，SC）是周圍神經(jīng)系統(tǒng)的膠質(zhì)細胞，包繞周圍神經(jīng)軸突形成有髓或無髓神經(jīng)纖維。SC能夠分泌表達數(shù)種神經(jīng)營養(yǎng)因子；防止受損神經(jīng)元胞體的死亡；促進軸突髓鞘化，從而促進損

3、傷的周圍及中樞神經(jīng)系統(tǒng)再生等。當周圍神經(jīng)肌肉損傷時，雪旺細胞增生活躍并分泌釋放大量的神經(jīng)營養(yǎng)物質(zhì)以促進神經(jīng)再生并參與維持正常骨骼肌的形態(tài)和功能以及損傷肌肉和神經(jīng)的修復。體外培養(yǎng)的成肌細胞受睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子或神經(jīng)提取液刺激后增殖迅速，肌小管的融合率明顯提高，表明神經(jīng)因素對成肌細胞的增殖、分化有促進作用。為更接近臨床應用，組織工程化人工肌肉將逐步從單一肌細胞三維培養(yǎng)向神經(jīng)、血管與肌肉復合型的肌組織構建過渡。隨著對肌肉損傷修復過程的分子機制了

4、解深入，SC被視為重要的影響因素參與到肌肉再生的過程中。然而，雪旺氏細胞對成肌細胞的生物學影響雖已有研究證明，但涉及到的成肌細胞基因表達變化尚沒有過多了解。因此深入研究SC對成肌細胞轉(zhuǎn)化時的基因表達變化，將促進神經(jīng)組織工程的發(fā)展，為復合型的骨骼肌重建提供理論支持。 本課題立足于實驗室前期的相關工作：雪旺細胞培養(yǎng)于與骨骼肌支架相連的管狀支架上，構建帶雪旺細胞索的組織工程化骨骼肌。但成肌細胞與雪旺細胞間的相互調(diào)節(jié)的分子機制不明，限制

5、了該工作的延續(xù)。 本實驗首先獲取原代培養(yǎng)的大鼠雪旺氏細胞，再與成肌細胞系L6共培養(yǎng)，通過細胞計數(shù)及倒置顯微鏡觀察細胞增殖與分化情況。數(shù)據(jù)顯示與雪旺氏細胞共培養(yǎng)的成肌細胞在增殖初期與對照組無明顯差異，至第三天共培養(yǎng)后表現(xiàn)出對數(shù)生長期的時間，明顯早于對照組。處理組的肌管形成率也較對照組為多。肌動蛋白的檢測，在第3天第5天兩個觀察時間點，處理組細胞已出現(xiàn)高表達，明顯強于對照組細胞。以上數(shù)據(jù)說明雪旺氏細胞的參與能夠有效的促進成肌細胞增殖

6、及終末分化。 為加深對共培養(yǎng)導致成肌細胞形態(tài)學改變的認識，本實驗還采用全基因組基因芯片進行檢測，研究SC對成肌細胞影響過程中的基因譜表達變化，以明確在誘導分化過程中，涉及到哪些基因的表達變化以及哪些代謝過程的改變。在處理組與對照組的細胞所獲RNA質(zhì)量保證的前提下，純化標記后與全基因組基因芯片進行雜交。雜交后的芯片經(jīng)數(shù)據(jù)分析后，共篩選出顯著上調(diào)基因12個，顯著下調(diào)基因221個。采用Panther工具對所獲差異表達基因進行分析，結果

7、表明與雪旺氏細胞共培養(yǎng)的成肌細胞在增殖與分化過程中涉及到多種細胞內(nèi)代謝過程的改變，差異基因主要與細胞增殖與分化、信號轉(zhuǎn)導、免疫與防疫、糖代謝、核酸代謝、以及鈣鐵離子轉(zhuǎn)運等途徑相關。從而提示上述細胞內(nèi)代謝過程是雪旺氏共培養(yǎng)影響成肌細胞增殖與分化的關鍵。而這些代謝過程中涉及到的關鍵基因的表達變化則可能是成肌細胞向終末方向分化的原因所在，針對這些基因的深入探討將有助于深入了解成肌細胞的終末分化理論，從而為以雪旺氏細胞和成肌細胞為基礎的復合型骨