涎腺腺樣囊性癌對神經(jīng)雪旺氏細(xì)胞的破壞及其阻斷.pdf

1、目的：雪旺氏細(xì)胞(Schwann cells，SCs)是包裹外周神經(jīng)的膠質(zhì)細(xì)胞，亦稱神經(jīng)膜細(xì)胞或鞘細(xì)胞。雪旺氏細(xì)胞包繞外周神經(jīng)纖維束，構(gòu)成有髓神經(jīng)纖維，成為有髓神經(jīng)的組成成份。
　　 涎腺腺樣囊性癌（salivary adenoid cystic carcinoma，SACC）是最常見的涎腺惡性腫瘤，易于早期浸潤神經(jīng)。在臨床上引起感覺異常、麻木和疼痛。以往認(rèn)為腫瘤對神經(jīng)的侵犯僅僅是一種占位，或“和平共處”，腫瘤不直接破壞神經(jīng)本身

2、。然而，腫瘤的嗜神經(jīng)生長能否對神經(jīng)造成直接破壞或侵蝕?目前尚不清楚。
　　 SACC中的腫瘤性肌上皮細(xì)胞（neoplastic myoepithelial cells，NMCs）具有雙向分化潛能，能夠分泌產(chǎn)生蛋白多糖(proteoglycans，PGs)。PGs是由一種由核心蛋白連接氨基葡聚糖(glycosaminoglycans，GAGs)所構(gòu)成的大分子糖蛋白，提供腫瘤的細(xì)胞外間質(zhì)，對于腫瘤的增殖、侵襲、分化和轉(zhuǎn)移都具有重要作

3、用。但是PG在SACC對神經(jīng)的侵犯和破壞中是否具有作用?目前的研究報道較少。在細(xì)胞中，PG的生物合成是在木糖基轉(zhuǎn)移酶(Xylosyltransferase，XT)催化下起始的。木糖基轉(zhuǎn)移酶-Ⅰ（Xylosyltransferase，XT-Ⅰ）催化的是PG合成中的效率-限制性階段（rate-limited step），對于PG的生物合成至關(guān)重要。
　　 目前應(yīng)用廣泛的RNA干擾(RNA interference，RNAi)技術(shù)，是

4、在細(xì)胞中導(dǎo)入與靶基因的mRNA編碼區(qū)同源的雙鏈RNA(dsRNA)，使mRNA發(fā)生降解，導(dǎo)致基因表達(dá)沉默。
　　 本研究體外培養(yǎng)人外周有髓神經(jīng)雪旺氏細(xì)胞(Human Schwann cells，HSc)，與SACC細(xì)胞共培養(yǎng)，觀察SACC細(xì)胞對人神經(jīng)雪旺氏細(xì)胞的侵襲及破壞情況。并應(yīng)用RNAi技術(shù)抑制SACC細(xì)胞的PG分泌，觀察PG阻抑前后SACC細(xì)胞對人神經(jīng)雪旺氏細(xì)胞的侵襲和破壞作用。以探討和證實(1)SACC細(xì)胞對人外周有髓神

5、經(jīng)雪旺氏細(xì)胞有無直接破壞?(2)PG在SACC細(xì)胞對人外周有髓神經(jīng)雪旺氏細(xì)胞破壞中有無發(fā)揮作用?
　　 方法：
　　 1.細(xì)胞培養(yǎng)：采用RPMI1640培養(yǎng)液培養(yǎng)SACC-83細(xì)胞；用DMED:F12培養(yǎng)液原代培養(yǎng)人神經(jīng)雪旺氏細(xì)胞(human Schwann cells)。并通過免疫細(xì)胞化學(xué)方法，應(yīng)用細(xì)胞角蛋白和肌球蛋白單克隆抗體鑒定SACC-83，S-100蛋白單克隆抗體鑒定人神經(jīng)雪旺氏細(xì)胞；
　　 2.細(xì)胞轉(zhuǎn)

6、染：將shRNA真核表達(dá)載體shRNA-WJ4（阻抑組）和shRNA-HK（陰性對照）通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染SACC-83細(xì)胞，沉默其XT-Ⅰ基因的表達(dá)；未轉(zhuǎn)染shRNA真核載體的SACC-83細(xì)胞（未轉(zhuǎn)染組）作為對照。
　　 3.XT-Ⅰ基因檢測：采用Real-Time PCR技術(shù)，從mRNA水平檢測RNAi后SACC-83細(xì)胞XT-Ⅰ基因的表達(dá)；
　　 4.PG含量測定：應(yīng)用Blyscan Assay Kit試劑盒檢測基因沉

7、默48h內(nèi)SACC-83細(xì)胞PG合成分泌的改變；
　　 5.腫瘤侵襲性觀察：將阻抑組SACC-83-WJ4細(xì)胞、對照組SACC-83-HK和未轉(zhuǎn)染組SACC-83分別與在24孔板培養(yǎng)的人神經(jīng)雪旺氏細(xì)胞混合培養(yǎng)24h，在倒置熒光顯微鏡和掃描電鏡(Scanning electron microscope，SEM)下進(jìn)行觀察，且對其進(jìn)行固定后應(yīng)用免疫組織化學(xué)染色，區(qū)分腫瘤細(xì)胞和人神經(jīng)雪旺氏細(xì)胞以便于人神經(jīng)雪旺氏細(xì)胞進(jìn)行侵襲率的計數(shù)。<

8、br>　　 6.統(tǒng)計學(xué)分析：所有實驗數(shù)據(jù)采用SPSS13.0統(tǒng)計分析軟件進(jìn)行方差分析，P＜0.01表示具有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 結(jié)果
　　 1.原代培養(yǎng)人神經(jīng)雪旺氏細(xì)胞，進(jìn)行S-100蛋白免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定。人神經(jīng)雪旺氏細(xì)胞胞漿呈棕褐色。SACC-83細(xì)胞對抗角蛋白CK和肌球蛋白myosin免疫細(xì)胞化學(xué)染色，細(xì)胞呈陽性表達(dá)。
　　 2.shRNA-WJ4（阻抑組）、shRNA-HK（陰性對照）成功轉(zhuǎn)染SACC-83

9、細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后穩(wěn)定表達(dá)綠色熒光蛋白(green fluorescent protein，GFP)轉(zhuǎn)染效率分別為51.44％、58.70％。SACC-83（未轉(zhuǎn)染組）不顯示熒光。
　　 3.基因轉(zhuǎn)染48h后，Real-Time PCR時實定量檢測發(fā)現(xiàn)，shRNA-WJ4中XT-Ⅰ基因mRNA沉默效率為49％。
　　 4.基因轉(zhuǎn)染后48h培養(yǎng)液Blyscan Assay Kit檢測發(fā)現(xiàn)，PG分泌降低。SACC-83-WJ4組P

10、G合成抑制率為41.32％。
　　 5.光鏡和掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，在SACC-83組中腫瘤細(xì)胞有聚集趨向，共同攻擊人神經(jīng)雪旺氏細(xì)胞；人神經(jīng)雪旺氏細(xì)胞受到腫瘤細(xì)胞的直接侵襲和破壞后，細(xì)胞漿離散解體，胞核固縮。而阻抑PG分泌的SACC-83-WJ4組中的腫瘤細(xì)胞，遠(yuǎn)離人神經(jīng)雪旺氏細(xì)胞，對雪旺氏細(xì)胞不產(chǎn)生侵蝕和破壞作用。
　　 結(jié)論：
　　 1.人SACC細(xì)胞能直接浸潤和破壞人外周神經(jīng)。
　　 2.蛋白多糖在SA