超支化納米載體轉(zhuǎn)基因修飾骨骼肌成肌細胞治療缺血性心臟病的研究.pdf

1、第一部分小鼠成體骨骼肌成肌細胞提取及純化方法的改進
　　 研究背景：
　　 作為成體種子細胞及基因治療工程細胞，高純度骨骼肌成肌細胞(skeletalmyoblasts，SkMs)在缺血性心臟病的治療中展示了良好的臨床應用前景。如何快速、高效、經(jīng)濟地獲取足量的高純度SkMs一直在不斷地進行摸索、改進。
　　 研究目的：
　　 建立一種快速、高效的小鼠成體SkMs提取、純化的實驗方法。
　　 研究方

2、法：
　　 通過布比卡因預處理激活肌骨骼肌中的SkMs，48h后，配制優(yōu)化混合酶，通過一步消化分離法及改良純化法，從成年骨骼肌中分離高純度SkMs，并與普通差速貼壁法、反復差速貼壁法及Percoll非連續(xù)密度梯度離心法等傳統(tǒng)純化方法分離的SkMs的純度相比較。
　　 研究結(jié)果：
　　 通過改良提取、純化法所得到的SkMs純度可達到92.59±1.29％，明顯高于普通差速貼壁法、反復差速貼壁法及Percoll非連續(xù)

3、密度梯度離心法(P＜0.05)，并具有很好的增殖及分化能力。
　　 研究結(jié)論：
　　 通過采用改良成體SkMs提取及純化法，能快速高效地獲取高純度SkMs。
　　 第二部分新型超支化聚酰胺胺納米載體介導基因轉(zhuǎn)染的研究
　　 研究背景：
　　 基因治療正逐步被應用于多種疾病的防治，前景十分廣闊。而在基因轉(zhuǎn)染的過程中，最關(guān)鍵的核心問題是如何選擇理想的基因載體。
　　 研究目的：
　　

4、探討一種新型的非病毒基因載體--超支化聚酰胺胺(hyperbranchedpolyamidoamine，h-PAMAM)納米顆粒在基因轉(zhuǎn)染中的效率、毒性及轉(zhuǎn)染后的基因表達情況。
　　 研究方法：
　　 以“改良-鍋法”合成h-PAMAM納米顆粒，將核酸(deoxyribonucleic acid，DNA)及h-PAMAM以不同的質(zhì)量比復合構(gòu)建h-PAMAM-DNA復合物，觀察其粒徑大小及Zeta電位情況；在核酸內(nèi)切酶的作

5、用下，觀察納米顆粒對質(zhì)粒的保護作用；以h-PAMAM-DNA復合物轉(zhuǎn)染COS7及HEK293細胞系，測定在不同質(zhì)量比情況下的轉(zhuǎn)染效率及細胞存活率，得出最優(yōu)化的轉(zhuǎn)染方案；h-PAMAM介導的人血管內(nèi)皮生長因子165(human vascular endothelial growth factor165，hVEG165)基因轉(zhuǎn)染后，測定hVEG165基因在轉(zhuǎn)染后的表達情況。
　　 研究結(jié)果：
　　 h-PAMAM-DNA復合

6、物的粒徑及zeta電位隨著h-PAMAM/DNA質(zhì)量比的增加而提高，h-PAMAM能保護質(zhì)粒不受核酸內(nèi)切酶的消化，保持其完整性和穩(wěn)定性長達2小時。h-PAMAM介導質(zhì)粒轉(zhuǎn)染時，最佳轉(zhuǎn)染條件下，轉(zhuǎn)染效率可達47.47±1.42％(COS7細胞)及40.8±0.98％(HEK293細胞)，此時細胞毒性較輕微，細胞存活率較高(COS7:91.38±0.46％；HEK293:92.38±0.61％)；h-PAMAM介導的hVEG165基因轉(zhuǎn)染后

7、，hVEG165能表達14天之久，峰值出現(xiàn)在第2天。
　　 研究結(jié)論：
　　 作為一種新型非病毒基因載體，h-PAMAM介導了一種經(jīng)濟、高效、安全的基因治療方法。
　　 第三部分新型超支化聚酰胺胺介導低氧調(diào)控血管內(nèi)皮生長因子基因轉(zhuǎn)染技術(shù)協(xié)同骨骼肌成肌細胞移植治療缺血性心臟病
　　 研究背景：
　　 骨骼肌成肌細胞(skeletal myoblasts，SkMs)移植協(xié)同血管內(nèi)皮生長因子(vascu

8、larendothelial growth factor，VEGF)基因治療是一種有潛力的治療缺血性心臟病的方案。然而，有待優(yōu)化的基因載體及不可調(diào)控的血管內(nèi)皮生長因子的表達阻礙了基因治療的應用。因此，尋求一種經(jīng)濟、高效、可控的基因轉(zhuǎn)染平臺非常是有必要的。
　　 研究目的：
　　 本實驗中，我們探討了超支化聚酰胺胺(hyperbranched polyamidoamine，h-PAMAM)納米顆粒介導的低氧可調(diào)控性人血管內(nèi)

9、皮生長因子165(hypoxiaregulated human vascular endothelial growth factor，HRE-hVEGF165)基因轉(zhuǎn)染協(xié)同SkMs移植治療缺血性心臟病的可行性及有效性。
　　 研究方法：
　　 將核酸(deoxyribonucleic acid，DNA)及h-PAMAM納米顆粒以不同的質(zhì)量比復合構(gòu)建h-PAMAM-DNA復合物，以復合物轉(zhuǎn)染SkMs，測定在不同質(zhì)量比情況下

10、的轉(zhuǎn)染效率及細胞存活率，得出最優(yōu)化的轉(zhuǎn)染方案；免疫染色、Realtime-PCR及Elisa法測定其基因轉(zhuǎn)染后的表達情況。將h-PAMAM-HRE-hVEGF165復合物修飾的SkMs移植至C57/BL6小鼠的缺血心肌中，探討心肌細胞凋亡情況，移植干細胞存活率，心梗面積及膠原沉積，血管密度及心功能。
　　 研究結(jié)果：
　　 h-PAMAM介導質(zhì)粒轉(zhuǎn)染SkMs時，最佳轉(zhuǎn)染條件下，轉(zhuǎn)染效率可達43.47±2.22％，此時細胞

11、毒性較輕微，細胞存活率較高(91.38±0.48％)。在低氧情況下，h-PAMAM介導的HRE-hVEG165基因轉(zhuǎn)染時能表達hVEGF165基因18天之久。h-PAMAM-pHRE-hVEG165修飾的SkMs移植至缺血心肌后，過表達的VEGF可導致心肌凋亡的減少，移植成肌細胞存活率的增加，梗死面積及膠原沉積的減少，血管密度的增加，從而抑制左室的重構(gòu)，提高了心功能。
　　 研究結(jié)論：
　　 h-PAMAM介導的HRE-