胰島素抵抗大鼠骨骼肌細(xì)胞蛋白激酶B的表達(dá)及羅格列酮的干預(yù)研究.pdf

1、2型糖尿病確切的發(fā)病機(jī)制目前還不是十分清楚，但幾乎所有的2型糖尿病病人都存在胰島素抵抗（IR），甚至在正常的生理情況下，也會(huì)發(fā)生IR，如妊娠等。許多研究顯示骨骼肌的胰島素抵抗是和2型糖尿病相聯(lián)系的重要缺陷之一。胰島素通過與胰島素受體結(jié)合而發(fā)揮其生理效應(yīng)，受體后異常即胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的異常是導(dǎo)致胰島素抵抗的重要原因。蛋白激酶B（protein kinase B，PKB）是由胰島素調(diào)節(jié)的若干受體后信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)因子之一，是胰島素作用主要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途

2、徑之一磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，P13K）途徑下游重要的絲氨酸/蘇氨酸激酶，PKB能通過影響胰島素的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)葡萄糖的攝取，糖原合成，糖酵解等胰島素代謝反應(yīng)[1]。羅格列酮作為胰島素增敏劑可以減輕IR，增加葡萄糖的攝入，但發(fā)揮作用的具體步驟不是十分清楚。IY294002是一種常用的P13K途徑抑制劑，可以通透細(xì)胞，特異性抑制P13K，抑制P13K/PKB信號(hào)途徑。本研究應(yīng)用棕櫚酸誘

3、導(dǎo)原代培養(yǎng)SD大鼠的四肢骨骼肌細(xì)胞形成胰島素抵抗模型，檢測(cè)該模型大鼠骨骼肌細(xì)胞在羅格列酮和LY294002分別作用后的胰島素誘導(dǎo)下的PKB的蛋白表達(dá)及磷酸化情況，探討羅格列酮是否通過該通路改善胰島素敏感性。
　　 材料與方法：
　　 在本項(xiàng)研究中，我們用膠原酶與胰酶雙重消化的方法原代培養(yǎng)SD大鼠的胎鼠的骨髂肌細(xì)胞，運(yùn)用差速貼壁法提純細(xì)胞，采用形態(tài)分析及免疫熒光技術(shù)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行雙重鑒定。然后用不同濃度的棕櫚酸作用于該細(xì)胞，誘

4、導(dǎo)后，用葡萄糖檢測(cè)試劑盒（葡萄糖氧化酶法）測(cè)定培養(yǎng)液中葡萄糖的含量，分析后得到穩(wěn)定的胰島素抵抗模型。設(shè)立正常細(xì)胞組（NG），胰島素抵抗細(xì)胞組（IR），羅格列酮干預(yù)組RO），LY294002并羅格列酮干預(yù)組（RL）。分別按組別給予羅格列酮20μmol/L處理24h，10μmol/L濃度LY294002預(yù)處理24h等處理因素，處理后分別給予濃度為1×10-7mol/L的胰島素孵育，孵育2、15、30分鐘后，用 western blottin

5、g方法檢測(cè)PKB的蛋白表達(dá)及磷酸化情況。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
　　 1、體外培養(yǎng)10天的成肌細(xì)胞由單核的長(zhǎng)梭形細(xì)胞逐漸融合為多核的管狀肌管，同向性排列生長(zhǎng)，甚至出現(xiàn)可收縮的肌纖維；免疫熒光技術(shù)鑒定細(xì)胞，α-Sarcomeric Actin特異性抗體染色結(jié)果顯示約96％的細(xì)胞胞漿呈陽性反應(yīng)，細(xì)胞核外周及胞漿呈紅色熒光，表明培養(yǎng)的細(xì)胞為骨骼肌細(xì)胞。
　　 2、0.6mM棕櫚酸作用于正常培養(yǎng)條件下原代培養(yǎng)的大鼠骨骼肌細(xì)胞

6、12-24h，能顯著抑制骨骼肌細(xì)胞胰島素刺激狀態(tài)下的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)，表明此模型已經(jīng)對(duì)生理劑量的胰島素產(chǎn)生耐受，且這種抑制作用呈劑量-時(shí)間依賴。
　　 3、PKB蛋白表達(dá)RO組低于NG組，高于IR組，RL組低于RO組，但都無顯著性意義。但是RO組PKB473位絲氨酸磷酸化水平較IR組明顯升高（P<0.05），RL組PKB473位絲氨酸磷酸化水平較RO組明顯降低（P<0.05）。
　　 結(jié)論：
　　 1、用膠原酶與胰酶雙

7、重消化，差速貼壁法提純可以得到狀態(tài)良好并且純度較高的原代培養(yǎng)骨骼肌細(xì)胞。
　　 2、0.6mM棕櫚酸作用于正常培養(yǎng)條件下原代培養(yǎng)的大鼠骨骼肌細(xì)胞12-24h，可以形成穩(wěn)定的胰島素抵抗骨骼肌細(xì)胞模型。
　　 3、棕櫚酸誘導(dǎo)的胰島素抵抗骨骼肌細(xì)胞模型中，存在PKB的激活作用受損。羅格列酮增加胰島素抵抗骨骼肌細(xì)胞敏感性的作用有PKB的參與，并且是通過上調(diào)骨骼肌細(xì)胞胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)P13K途徑中PKB 473位絲氨酸磷酸化水平