轉(zhuǎn)錄因子Arx的核質(zhì)分布在調(diào)控C2C12細胞分化中的作用.pdf

1、同源異型蛋白是一類含有同源異型結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄因子,它們控制著許多細胞過程,包括細胞的增殖、分化、凋亡等,在胚胎發(fā)育中對組織和器官的形成具有重要的調(diào)控作用。在細胞核中,同源異型蛋白通過同源異型結(jié)構(gòu)域組成的α螺旋-轉(zhuǎn)角-α螺旋結(jié)構(gòu)結(jié)合DNA,從而調(diào)控著下游基因的表達。
　　肌肉調(diào)節(jié)因子(MRFs)和肌細胞增強因子2(MEF2)是骨骼肌發(fā)生中的重要轉(zhuǎn)錄因子。此外同源異型蛋白對骨骼肌發(fā)生也起著重要的作用。Six1同源異型蛋白在早期肌源細胞決

2、定、成肌細胞增殖、肌纖維形成和肌纖維類型決定中都起著重要的作用,它能夠結(jié)合肌肉調(diào)節(jié)因子myogenin啟動子上的MEF3位點,激活轉(zhuǎn)錄,引起成肌細胞的分化。胚胎期、嬰兒期和成體分離出的成肌細胞中均能檢測到同源異型蛋白Arx的表達,但是其在肌分化中的調(diào)控機制尚不清楚。
　　本研究應(yīng)用成肌細胞C2C12體外分化模型,系統(tǒng)研究了同源異型蛋白Arx通過其核質(zhì)分布的變化調(diào)控SIX1的表達進而調(diào)節(jié)C2C12細胞分化的分子機制。通過異核體細胞融

3、合實驗,我們首次發(fā)現(xiàn)并確定了Arx蛋白是一個核質(zhì)穿梭蛋白。在缺失突變實驗中,推斷出Arx具有出核功能的酸性氨基酸結(jié)構(gòu)域(a.a.200-250),應(yīng)用蛋白質(zhì)相互作用方法,初步確定了CAS是Arx的出核轉(zhuǎn)運受體。同時我們觀察到內(nèi)源Arx在C21C2細胞的分化中有出核現(xiàn)象,即未分化細胞Arx主要分布在細胞核中,細胞分化時,Arx主要分布在細胞質(zhì)中,而Arx在C2C12分化中的表達量并沒有變化。通過對Arx可能作用的且與成肌細胞分化有關(guān)基因的

4、啟動子序列分析,我們推測SIX1基因可能是Arx結(jié)合的靶基因,應(yīng)用熒光素酶活性檢測實驗,凝膠遷移實驗和染色質(zhì)免疫共沉淀實驗,證明Arx可以直接與SIX1啟動子結(jié)合,抑制Sixl的表達。另外我們還發(fā)現(xiàn)在C2C12細胞中,外源表達的Arx蛋白能夠通過抑制Six1的表達阻止分化,并且Arx在缺失出核信號的情況下,抑制作用更加明顯。相反,Arx同源異型結(jié)構(gòu)域上382位點突變由于不能與SIX1基因結(jié)合而失去轉(zhuǎn)錄抑制功能,細胞分化正常進行。本研究首