Bcl-2在HSP70抗H-,2-O-,2-所致C2C12細(xì)胞凋亡中的作用研究.pdf

1、近年研究表明，細(xì)胞凋亡是導(dǎo)致心肌損傷的重要細(xì)胞機(jī)制之一，在心肌缺血/再灌注損傷、心肌梗死、心肌重塑及心力衰竭等心臟疾病或病理過(guò)程的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮了重要作用。熱休克蛋白（heat shock protein，HSP）是細(xì)胞在生理狀態(tài)下必需而在應(yīng)激狀態(tài)（特別是熱應(yīng)激）時(shí)表達(dá)增多的一類細(xì)胞內(nèi)源性保護(hù)蛋白。本室以往研究證實(shí)HSP70能通過(guò)減少促凋亡蛋白Smac的釋放而顯著抑制H2O2誘導(dǎo)的C2C12肌源細(xì)胞凋亡。然而，HSP70影響Smac釋放

2、和抗細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制仍不清楚。Bcl-2是最早發(fā)現(xiàn)的抗凋亡蛋白，具有穩(wěn)定線粒體膜的功能，國(guó)外研究表明Bcl-2能抑制凋亡刺激所致Smac從線粒體的釋放。但HSP70影響Smac釋放和抗細(xì)胞凋亡的作用是否與Bcl-2有關(guān)，目前還不清楚。 本實(shí)驗(yàn)首先采用HSP70基因轉(zhuǎn)染及其反義寡核苷酸技術(shù)，探討HSP70對(duì)Bcl-2表達(dá)的影響；再采用HSP70過(guò)表達(dá)的C2C12肌源細(xì)胞株，運(yùn)用H2O2處理構(gòu)建細(xì)胞凋亡模型，在Bcl-2表達(dá)上調(diào)與

3、抑制的情況下，探討B(tài)cl-2在HSP70抗細(xì)胞凋亡中的作用，并且通過(guò)檢測(cè)Smac從線粒體釋放情況及caspase-3，9活化情況，進(jìn)一步揭示HSP70抗細(xì)胞凋亡的分子機(jī)理。主要結(jié)果如下：①穩(wěn)定轉(zhuǎn)染HSP70的C2C12細(xì)胞株，與轉(zhuǎn)空載體組相比，HSP70的表達(dá)較高，Bcl-2的表達(dá)也明顯升高（p<0.01 vs pcDNA3.1）；而轉(zhuǎn)染HSP70反義寡核苷酸后，與轉(zhuǎn)隨機(jī)寡核苷酸組相比，C2C12細(xì)胞內(nèi)HSP70的表達(dá)降低，Bcl-2的

4、表達(dá)也明顯降低（p<0.01 vs Scr-Hsp70）。②穩(wěn)定轉(zhuǎn)染HSP70的C2C12細(xì)胞株，分別轉(zhuǎn)染Bcl-2反義寡核苷酸及隨機(jī)寡核苷酸后，0.5mmol/LH2O2處理2小時(shí)，細(xì)胞成分分離后Western-blot結(jié)果顯示：在隨機(jī)寡核苷酸組，Smac主要存在線粒體中，其胞漿含量較低；而在反義寡核苷酸組，較多Smac從線粒體釋放，其胞漿含量顯著升高。③穩(wěn)定轉(zhuǎn)染HSP70的C2C12細(xì)胞株，分別轉(zhuǎn)染Bcl-2反義寡核苷酸及隨機(jī)寡核苷

5、酸后，0.5mmol/LH2O2處理8小時(shí)，凋亡蛋白酶活性檢測(cè)顯示，在隨機(jī)寡核苷酸組細(xì)胞內(nèi)caspase-9、3活性較低，而在反義寡核苷酸組細(xì)胞內(nèi)caspase-9、3活性較高。④穩(wěn)定轉(zhuǎn)染HSP70的C2C12細(xì)胞株，分別轉(zhuǎn)染Bcl-2反義寡核苷酸及隨機(jī)寡核苷酸后，0.5mmol/LH2O2處理24小時(shí)，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)顯示，在隨機(jī)寡核苷酸組細(xì)胞凋亡率較低，而在反義寡核苷酸組細(xì)胞凋亡率較高。 結(jié)論：①HSP70能上調(diào)Bcl-2的表