H-,2-O-,2-在綠豆不定根形成與發(fā)育中的信號作用及其機(jī)理.pdf

1、H<,2>O<,2>是植物細(xì)胞的可移動的信號分子，是植物細(xì)胞代謝的正常產(chǎn)物，各種生物和非生物脅迫能促使植物細(xì)胞產(chǎn)生過量H<,2>O<,2>，并通過H<,2>O<,2>信號轉(zhuǎn)導(dǎo)響應(yīng)環(huán)境脅迫。H<,2>O<,2>信號調(diào)控一系列重要的植物生理生化過程和基因表達(dá)，如系統(tǒng)獲得抗性(SAR)和高度敏感抗性(HR)，細(xì)胞衰老與程序化死亡(PCD)，氣孔關(guān)閉，根的向地性、根和側(cè)根的生長，細(xì)胞壁的發(fā)育，柱頭與花粉粒間的關(guān)系等。Ca<'2+>流動和可逆蛋白

2、磷酸化作用是H<,2>O<,2>信號途徑的下游信號，通過MAPK級聯(lián)作用于轉(zhuǎn)錄因子，最終調(diào)控基因的表達(dá)。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)H<,2>O<,2>調(diào)控多種基因的表達(dá)，包括編碼抗氧化酶基因和調(diào)控H<,2>O<,2>產(chǎn)生的蛋白，以及過氧物酶體生物發(fā)生所需要的蛋白。雖然近年來對H<,2>O<,2>信號及其功能的研究取得了一系列重要進(jìn)展，但關(guān)于H<,2>O<,2>在植物不定根形成與發(fā)育過程中的信號作用的研究還未見文獻(xiàn)報道。 不定根是指從莖、葉和老根的

3、非中柱鞘組織產(chǎn)生的根，是植物無性繁殖的重要途徑之一，普遍存在于被子植物和裸子植物界。各種外部環(huán)境的和內(nèi)部的因子調(diào)控不定根的發(fā)生，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的內(nèi)部調(diào)控因子有礦質(zhì)營養(yǎng)元素、糖、酚類、乙烯、多胺、NO、H<,2>O<,2>、CO、cGMP、MAPKs、植物激素和過氧化物酶等，其中生長素信號對不定根的形成起著關(guān)鍵作用，Ca<'2+>、乙烯、NO、H<,2>O<,2>、CO、cGMP、MAPK等可能都是生長素信號途徑中的信使分子，參與了生長素誘導(dǎo)的

4、不定根形成的信號途徑，并最終調(diào)控生長素響應(yīng)基因和不定根響應(yīng)基因的表達(dá)。近年來，對生長素和不定根響應(yīng)信號的研究受到廣泛關(guān)注，并取得了許多重要成果，如發(fā)現(xiàn)NO是生長素誘導(dǎo)的不定根形成的信號分子，在不定根的誘導(dǎo)中IAA可能是通過NO而起作用的，cGMP和MAPK級聯(lián)是NO信號途徑的下游分子。那么，在不定根的誘導(dǎo)中，與NO性質(zhì)相似的H<,2>O<,2>是否也具有與NO相同的信號作用，正是本文需要研究的問題。 本文基于當(dāng)前的研究進(jìn)展，運(yùn)用

5、形態(tài)學(xué)、生理學(xué)和生物化學(xué)的研究方法，以綠豆(Mucuna pruriens(Linn.)DClJar.utilis)為研究材料，研究了H<,2>O<,2>在不定根形成與發(fā)育中的作用、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及其可能的生理生化機(jī)理。本文取得的主要結(jié)果與結(jié)論如下。 1．外源H<,2>O<,2>具有促進(jìn)綠豆幼苗外植體不定根形成與生長的作用。用1-100 mMH<,2>O<,2>處理8-18 h能顯著促進(jìn)不定根的形成與生長，H<,2>O<,2>清除劑C

6、AT和ASA能去除外源H<,2>O<,2>對不定根形成和生長的促進(jìn)作用。CAT是H<,2>O<,2>的敏感的清除劑，外源CAT對不定根的形成和生長沒有顯著影響，但外源100 U CAT和H<,2>O<,2>一同處理時，外源H<,2>O<,2>對不定根的促進(jìn)作用被CAT去除；H<,2>O<,2>是ASA最重要的降解底物，4 mM ASA與H<,2>O<,2>一同處理時，外源H<,2>O<,2>對不定根的促進(jìn)作用被ASA去除。 2．

7、H<,2>O<,2>是生長素誘導(dǎo)的綠豆幼苗外植體不定根形成過程中的信號分子。TIBA通過抑制IAA向莖基部的極性運(yùn)輸而強(qiáng)烈抑制不定根的形成，大于1 μM的TIBA強(qiáng)烈抑制綠豆幼苗外植體不定根的形成，而TIBA對不定根形成的抑制作用能被IAA部分地逆轉(zhuǎn)，同時也能被H202部分地逆轉(zhuǎn)，這說明IAA誘導(dǎo)綠豆不定根的形成可能是通過H<,2>O<,2>而起作用。 3．H<,2>O<,2>可能作為生長素的下游信號，參與生長素誘導(dǎo)的不定根形成

8、的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。DPI專一性抑制細(xì)胞內(nèi)NADPH途徑的H<,2>O<,2>的產(chǎn)生，發(fā)現(xiàn)10μM DPI處理48 h能強(qiáng)烈抑制綠豆不定根的形成，而H<,2>O<,2>和IBA能夠部分地逆轉(zhuǎn)DPI的抑制作用，這說明當(dāng)NADPH氧化酶途徑的內(nèi)源H<,2>O<,2>的產(chǎn)生被抑制后，不定根的形成同時被抑制，證明H<,2>O<,2>可能參與了IBA誘導(dǎo)的不定根形成的信號過程。 4．H<,2>O<,2>可能只是生長素誘導(dǎo)的不定根形成過程中的下游信

9、號之一。CAT與IBA一同處理時，CAT不能去除IBA對不定根的促進(jìn)作用，是由于CAT是非細(xì)胞透過的，所以對內(nèi)源H<,2>O<,2>沒有清除作用：由于ASA是細(xì)胞透過的，外源ASA能夠清除細(xì)胞內(nèi)的H<,2>O<,2>，ASA能夠去除外源H<,2>O<,2>誘導(dǎo)的不定根數(shù)量的增加，但對IBA誘導(dǎo)的不定根形成沒有明顯去除作用，這可能說明，H<,2>O<,2>只是生長素響應(yīng)的不定根形成信號網(wǎng)絡(luò)中的成員之一。 5．IBA處理能夠顯著促進(jìn)

10、綠豆幼苗外植體細(xì)胞內(nèi)H<,2>O<,2>的產(chǎn)生。在初生根切除后3 h時，與H<,2>O處理相比較，IBA處理顯著增加H<,2>O<,2>的濃度，這說明IBA誘導(dǎo)H<,2>O<,2>的產(chǎn)生，暗示IBA對不定根形成的誘導(dǎo)作用可能是通過H<,2>O<,2>實現(xiàn)的。 6．H<,2>O<,2>和NO可能是生長素信號途徑中兩個平行的下游信號分子。已知NO是IAA誘導(dǎo)的不定根形成過程中的信號分子，但當(dāng)用DPI抑制H<,2>O<,2>的產(chǎn)生，不

11、僅抑制H<,2>O<,2>對不定根的誘導(dǎo)作用，而且NO誘導(dǎo)的不定根的形成作用也被抑制。這可能暗示H<,2>O<,2>和NO都是生長素信號途徑的下游分子，而且H<,2>O<,2>可能位于NO的下游。 7．Ca<'2+>可能是H<,2>O<,2>下游信號分子。胞外Ca<'2+>螯合劑EDTA(1 mM)對綠豆幼苗外植體不定根的形成沒有顯著地抑制作用，而胞內(nèi)Ca<'2+>釋放抑制劑釕紅(10μM)則完全抑制了不定根的形成，且這種抑制作

12、用不能被H<,2>O<,2>和IBA去除，釕紅(10μM)也完全抑制H<,2>O<,2>和IBA對不定根形成的誘導(dǎo)作用，這說明Ca<'2+>的流動是不定根形成所需要的，且Ca<'2+>可能是H<,2>O<,2>下游信號分子。 8．cGMP可能是H<,2>O<,2>信號途徑的下游成員。GMP環(huán)化酶專一性抑制劑LY83583(20μM)對綠豆幼苗外植體不定根的形成與生長有顯著抑制作用，LY83583與cGMP類似物8-Br-cGMP

13、、H<,2>O<,2>或IBA共同處理時，8-Br-cGMP、H<,2>O<,2>和IBA能部分逆轉(zhuǎn)LY83583的抑制作用，這說明H<,2>O<,2>和IBA可能促進(jìn)cGMP的合成，進(jìn)而促進(jìn)不定根的形成，cGMP可能是H<,2>O<,2>信號途徑的下游成員。 9．MAPK級聯(lián)參與了生長素響應(yīng)的植物不定根信號途徑，且MAPK信號級聯(lián)位于H<,2>O<,2>信號的下游。MAPKK專一性抑制劑PD98059(30μM)完全抑制綠豆幼

14、苗外植體不定根的形成，PD98059也完全抑制H<,2>O<,2>和IBA誘導(dǎo)的不定根的形成，表明，MAPK級聯(lián)參與了生長素響應(yīng)的植物不定根信號途徑，且MAPK信號級聯(lián)位于H<,2>O<,2>信號的下游。 10．與IBA的作用機(jī)理相似，H<,2>O<,2>和IBA處理都能顯著降低不定根誘導(dǎo)階段POD的活性，與這一時段需要較高的IAA濃度相關(guān)，而較高的IAA濃度可能在于促進(jìn)H<,2>O<,2>的產(chǎn)生，啟動H<,2>O<,2>信號轉(zhuǎn)

15、導(dǎo)。在綠豆幼苗外植體不定根形成的0 h-48 h內(nèi)，POD活性的變化基本遵循降-升-降-升的規(guī)律，當(dāng)用H<,2>O<,2>2和IBA處理后3 h時，POD活性顯著降低，在3 h-36 h之間，POD活性發(fā)生升降的變化，而在36 h后，POD活性升高，這一時段要求較低的IAA濃度以保證不定根原基的長出，較高的POD活性促進(jìn)內(nèi)源IAA的分解，降低了內(nèi)源IAA的濃度，可能也在于降低H<,2>O<,2>的濃度。 11．在綠豆幼苗外植體不

16、定根形成的0 h-48 h階段，CAT活性保持在一個相對穩(wěn)定的水平，僅有比較小的變化，而這些變化基本沒有統(tǒng)計學(xué)意義，這可能暗示，在不定根的誘導(dǎo)與根原基的形成階段，CAT對細(xì)胞內(nèi)H<,2>O<,2>濃度的變化不如POD敏感。 12．H<,2>O<,2>和IBA處理都能顯著降低不定根誘導(dǎo)階段APX的活性，APX活性的變化規(guī)律與POD活性的變化極其相似，在不定根的形成過程中，APX與POD活性的變化具有同等意義，進(jìn)一步說明H<,2>O

17、<,2>與IBA的作用機(jī)理相同。IBA和H<,2>O<,2>處理，在0h-3h時間段降低APX活性，在36h-48h時間段升高APX活性，APX活性在48h時均達(dá)到峰值。 綜上，我們認(rèn)為H<,2>O<,2>在綠豆幼苗外植體不定根形成過程中，起信號分子的作用，能夠促進(jìn)不定根形成與生長，生長素對不定根形成的誘導(dǎo)作用可能是通過H<,2>O<,2>而起作用的，H<,2>O<,2>和NO可能是生長素信號途徑中的兩個平行的下游分子，且H<,