煙草NtFAD2基因的沉默及功能研究.pdf

1、油酰磷脂酰膽堿去飽和酶(FAD2)是一種重要的植物脂肪酸去飽和酶，位于內質網中，催化油酸生成亞油酸。亞油酸等多不飽和脂肪酸含量過高的植物油脂不穩(wěn)定，易氧化，不易貯藏，而且氧化產物對人體有害。因此油脂改良的一個重要目的是提高種子油脂的油酸含量，降低多不飽和脂肪酸含量。另外，關于FAD2的結構、功能和表達調控等問題目前還不清楚，有待深入研究。近年發(fā)展起來的RNAi技術可有效地沉默目標基因，研究植物FAD2基因沉默后膜脂和油脂的變化及溫度對基

2、因沉默的影響，有助于深入理解FAD2酶的功能、表達調控方式和有效地利用基因沉默技術改變膜脂組成、提高植物油脂品質。本研究的主要目的是，首先采用RNAi技術抑制煙草FAD2基因(NtFAD2)的表達以降低NtFAD2酶活性，得到膜脂不飽和度改變的煙草轉基因株系。然后研究NtFAD2基因沉默后脂肪酸去飽和過程的變化及其機理，以及溫度對NtFAD2基因沉默的影響。研究中首先用PCR方法克隆煙草NtFAD2基因，用其編碼區(qū)的一個片段構建表達發(fā)卡

3、RNA的沉默結構，用農桿菌介導的方法轉化煙草，從第一代轉基因植株中篩選出油酸含量高的突變體。然后對其中一個轉基因株系S61進行脂肪酸分析，發(fā)現(xiàn)葉片總脂和質體外單脂PC和PE中的油酸含量大幅度增加。此外，NtFAD2基因沉默對葉片甘油脂的影響有多效性，即質體內的單脂油酸含量也有顯著增加，有些單脂中軟脂酸含量有所下降。煙草NtFAD2基因沉默后，在葉片和種子中油酸含量變化最大，說明NtFAD2基因在不同器官中的沉默效果不同：沉默結構對NtF

4、AD2酶活性較高的器官抑制程度更大，內源基因沒有表現(xiàn)均一的沉默效果。沉默植株的多種組織中NtFAD2基因的mRNA降解程度相似，說明油酸含量與NtFAD2轉錄本的豐度沒有直接關系。
　　 植物脂肪酸的不飽和程度受溫度調控，因此研究FAD2基因沉默株系的油酸含量受溫度影響情況及其調控規(guī)律對RNAi技術在油脂改良方面的實際應用具有十分重要的意義。研究結果表明，隨著生長溫度的下降，野生煙草葉片膜脂油酸含量降低，多不飽和脂肪酸含量隨之增

5、加；轉基因煙草中油酸和多不飽和脂肪酸有相似的變化趨勢，但是變化幅度遠遠大于野生煙草。低溫下轉基因煙草葉片油酸含量之所以大幅度下降，其中一個重要原因是被抑制的NtFAD2酶受低溫的調節(jié)而活性升高。然而研究發(fā)現(xiàn)，與常溫條件下相比，低溫下轉基因煙草NtFAD2基因的mRNA豐度不變，說明低溫沒有影響沉默結構對NtFAD2基因的mRNA的降解。低溫環(huán)境下NtFAD2基因沉默植株的多不飽和脂肪酸含量有所回升可能是植物對低溫的一種適應性響應。轉基因