三七SE基因克隆及轉(zhuǎn)化煙草、絞股藍(lán)的初步研究.pdf

1、本論文研究包括三方面： (一)建立絞股藍(lán)葉片直接分化受體系統(tǒng)以廣西五葉絞股藍(lán)葉片作為研究材料，在葉片不同部位切割并插入不同激素組合的培養(yǎng)基誘導(dǎo)，確定6-BA可誘導(dǎo)葉片分化不定芽后，采用不同濃度的6-BA進(jìn)行誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)，當(dāng)采用MS+6-BAl.0mg/L培養(yǎng)基時(shí)，絞股藍(lán)葉片分化頻率最高，達(dá)到40％。植株再生過程中，繼代培養(yǎng)基采用MS+6-BAl.0mg/L；生根培養(yǎng)基采用1/2MSO；根系長(zhǎng)好后移栽并成活，獲得完整植株。首次成功誘導(dǎo)

2、絞股藍(lán)葉片分化，為利用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法進(jìn)行基因轉(zhuǎn)化絞股藍(lán)研究建立了穩(wěn)定的直接分化受體系統(tǒng)。 (二)三七鯊烯環(huán)氧酶(SE)基因克隆并構(gòu)建雙元轉(zhuǎn)化載體系統(tǒng)提取三七莖總RNA，經(jīng)RF-PCR得到SE基因，經(jīng)過測(cè)序確認(rèn)無堿基突變后，通過基因工程將SE基因重組入中間表達(dá)載體pCAMBIA2301(35S：NOS-ter)，經(jīng)雙酶切鑒定得到重組中間表達(dá)載體pCAMBIA2301(35S：NOS-ter)-SE。將其轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌GV3 10

3、1，經(jīng)PCR鑒定得到雙元轉(zhuǎn)化載體系統(tǒng)GV3101-pCAMBIA2301(35S：NOS-ter)-SE。 (三)目的基因(SE)轉(zhuǎn)化煙草、絞股藍(lán)利用葉盤轉(zhuǎn)化法探索將SE基因轉(zhuǎn)入絞股藍(lán)的條件與方法，但未成功。同時(shí)利用葉盤轉(zhuǎn)化法將目的基因SE轉(zhuǎn)化入煙草中，提取煙草基因組DNA經(jīng)PCR鑒定，SE基因轉(zhuǎn)入煙草成功。提取煙草葉片總RNA經(jīng)RT-PCR鑒定，SE基因在煙草體內(nèi)表達(dá)，成功獲得轉(zhuǎn)SE基因煙草。本研究建立了絞股藍(lán)葉片分化系統(tǒng)，構(gòu)