梅、中國李PGIP基因及其啟動子的克隆和梅PGIP基因轉(zhuǎn)化煙草的研究.pdf

1、多聚半乳糖醛酸酶是真菌侵染植物時分泌的第一個酶。它因能降解植物細(xì)胞壁，從而促成了真菌對植物的侵入和植物發(fā)病。多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白(PGIP)是存在于多種植物細(xì)胞壁中的一種糖蛋白，它能專一性識別真菌內(nèi)切多聚半乳糖醛酸酶并抑制其活性，在一定程度上抑制真菌對植物細(xì)胞壁的降解。此外，兩者相互作用產(chǎn)生的大片段細(xì)胞壁多糖降解物能夠激發(fā)植物防衛(wèi)系統(tǒng)，引發(fā)植物自身防衛(wèi)反應(yīng)的發(fā)生。因此該蛋白在植物抵制真菌病害的發(fā)生中發(fā)揮著重要作用。 本實驗以

2、梅和中國李兩種果樹為材料，克隆了PGIP基因及其上游的啟動子序列，并通過相關(guān)軟件，對它們的結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)行了分析。同時構(gòu)建了PGIP基因的高效表達(dá)載體，進(jìn)行了煙草的轉(zhuǎn)化研究。現(xiàn)將主要研究結(jié)果匯總?cè)缦拢?1.利用梅葉片基因組DNA為模板，PGIP基因保守序列為引物，通過PCR克隆到了梅PGIP基因的全長DNA序列(Genbank登錄號：AY764131)。 2.利用中國李葉片基因組DNA為模板，PGIP基因保守序列為引物，通

3、過PCR克隆到了中國李PGIP基因的全長DNA序列(Genbank登錄號：DQ20087)。 3.梅、中國李PGIP基因序列分析結(jié)果表明，它們與杏、桃、馬哈利櫻桃PGIP基因序列一致度為95％-97％，包含有完整的編碼區(qū)域和典型的內(nèi)含子拼接位點。其翻譯的蛋白質(zhì)序列含有抗病蛋白所共有的10個亮氨酸重復(fù)序列。分子進(jìn)化樹中，兩條基因序列與杏、桃、馬哈利櫻桃的PGIP基因序列位于同一類，而與山楂、草莓、柑橘類、蘋果等中的PGIP基因序列

4、相距較遠(yuǎn)。梅、中國李PGIP基因核酸序列之間存在46個堿基差異，其蛋白序列中有15個氨基酸存在差異，但都不在PGIP的功能位點上。 4.以梅葉片基因組DNA為模板，通過梅PGIP基因5’端的外顯子區(qū)反向設(shè)計引物，PCR擴增到了一條1311bp的片段(Genbank登錄號：DQ364056)。結(jié)構(gòu)分析后發(fā)現(xiàn)，該片段中包含了一段長1038bp的PGIP基因啟動子序列。 5.以中國李葉片基因組DNA為模板，李PGIP基因5’端的外顯子

5、區(qū)為引物，通過PCR擴增，獲得了一條2338bp的片段(Genbank登錄號：DQ364055)。結(jié)構(gòu)分析后發(fā)現(xiàn)，該片段中包含了一段長1870bp的啟動子序列。 6.梅、中國李PGIP基因啟動子的BLAST分析結(jié)果表明，NCBI中無相似核酸序列與該啟動子區(qū)段相匹配。對GenBank、EMBL和DDBJ三個核酸數(shù)據(jù)庫中收錄的139條PGIP基因相關(guān)信息進(jìn)行分析后，發(fā)現(xiàn)目前三個數(shù)據(jù)庫中均無PGIP基因啟動子序列注釋。對已經(jīng)完成測序的

6、模式植物擬南芥和水稻基因組注釋進(jìn)行了分析，僅在擬南芥基因組中發(fā)現(xiàn)了PGIP基因啟動子的注釋。進(jìn)一步對梅、中國李、擬南芥三者中的PGIP基因啟動子進(jìn)行序列相似性分析，結(jié)果表明，擬南芥與梅、中國李PGIP啟動子差異非常大，幾乎沒有相似的區(qū)段；而梅、中國李PGIP啟動子卻非常相似。 7.啟動子順式調(diào)控元件分析表明，梅、中國李啟動子序列中均包含有TATA框、CAAT框等基本的基因組成型調(diào)控元件；同時還包含有三類抗病相關(guān)元件，分別是SEB

7、FCONSSTPR10A元件、GT1元件、WBBOXPCWRKY1元件。表明PGIP基因的表達(dá)與病原菌侵染、機械損傷和水楊酸誘導(dǎo)有關(guān)。 8.構(gòu)建了在梅PGIP基因的植物雙元表達(dá)載體，并將其導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌LBA4404中，然后轉(zhuǎn)化煙草，獲得了25株hyg抗性苗。其中的13株抗性苗PCR檢測結(jié)果表明，12株擴增出了目的條帶。再從中取7株進(jìn)行Southern雜交檢測，發(fā)現(xiàn)7個株系中均整合了目的基因。進(jìn)一步的RT-PCR檢測結(jié)果表明，7