不同啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)GroEL基因和dsRNA介導(dǎo)的煙草抗TYLCV的研究.pdf

1、安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文不同啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)GroEL基因和dsRNA介導(dǎo)的煙草抗TYLCV的研究姓名：吳丹申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：碩士專業(yè)：生態(tài)學(xué)指導(dǎo)教師：王榮富;張保龍20090601A b s t r a c tG e m i n i v i r u s e s a r e a g r o u p o f s i n g l e —s t r a n d e d c i r c u l a r D N Av i r u s e s o c c u

2、 r r e dw o r l d w i d e ，a n d c a u s e ds e v e r ed i s e a s e s i ns e v e r a le c o n o m i c a l l y i m p o r t a n t c r o p s ．I nC h i n a ,S e v e r a lk i n d s o f b e g o m o v i r u s e s w e r ei d e

3、n t i f i e di n t o m a t o ，t o b a c c oa n ds q u a s hi n Y u n n a na n d G u a n g x ip r o v i n c e ．H e r e ，G r o E Lg e n ew a s c o n s t r u c t e dt h r e e e x p r e s s i o nv e c t o r s w h i c hi s o

4、l a t e df r o me n d o s y m b i o n t s o f B e m i s i a t a b a c i ，a n dA C 1 ，A C 2r e p e a tg e n ew a s c o n s t r u c t e dR N A i n t e r f e r e n c e e x p r e s s i o n v e c t o r w h i c h c o m e s f r

5、 o m T o m a t o y e l 腸w t e a f c u r lv i r u s ( T Y L C V ) ．T h e v e c t o r sw e r et r a n s f o r m e d i n t oA g r o b a c t e r i u mt u m e f a c i e n s ，r e s i s t a n c eo ft h e s e t r a n s g e n i c

6、t o b a c c o p l a n t sw e r e e v a l u a t e d ．G e tt h e r e s u l t sa sb e l o w ：1 ．W i t ht h ep u r p o s e o f e n h a n c i n g t h e r e s i s t a n t p l a n t sa g a i n s tT Y L C V ，t h eG r o E L g e n

7、 ew h i c h d r i v e n b yC a M V 3 5 S ，S U C 2 ，P G H N B S p r o m o t e r s w a s e x p l o i t e df r o m B e m i s i a t a b a c i ．T h r e e p l a n t e x p r e s s i o n v e c t o r s ( P —G r o E L ，P —S U E 2

8、- G r o E L ，P —P G H N B S —G r o E L ) w e r es u c c e s s f u l l yc o n s t r u c t e d ．2 ．P —G r o E L 、P —P G H N B S —G r o E L 、P ·S U C 2 - G r o E Lw e r e t r a n s f o r m e d i n t oA g r o b a c t e

9、r i u mt u m e f a c i e n sL B A 4 4 0 4 ．T h ep o s i t i v ec l o n e sc o n f i r m e db yP C R a n dd i g e s t i o nw e r eu s e df o rt r a n s f o r m a t i o n o f t o b a c c o p l a n t s ．T h e v e c t o r s

10、W e r e t r a n s f o r m e d i n t o t o b a c c o b yA g r o b a c t e r i u m t u m e f a c i e n s - m e d i a t e d m e t h o d v i a l e a f d i s c ．S o m e k a n a m y c i n - r e s i s t a n tt r a n s g e n i c

11、p l a n t se x p r e s s i n g G r o E L g e n ew e r eo b t a i n e d ．T h er e s u l to f R T —P C R p r o v e dt h a tG r o E L g e n ew a s e x p r e s s e d i n t h r e er e g e n e r a t e dK a n a m y c i n r e s

12、i s t a n tt o b a c c op l a n t s ．V i r u si n f e c t i o na t t h ef i r s tt i m e ，1 9r e s i s t a n tt o b a c c op l a n t sa c q u i r e d ：7p l a n t sw e r et r a n s f o r m e dw i t he x p r e s s i o nv e

13、 c t o r P —G r o E L ，P —P G H N B S —G r o E La n d P - S U C 2 一G r o E L s e p a r a t e l yh a v e6r e s i s i t a n tt o b a c c op l a n t s ．F o l l o w i n g ，v i r u si n f e c t i o na tt h es e c o n d t i m

14、e ，i tW a s s h o w n t h a t7r e s i s t a n t t o b a c c op l a n t s a c q u i r e d ：o n l yo n eo ft h e m t r a n s f o r m e dw i t h e x p r e s s i o nv e c t o rP - G r o E L ．H o w e v e r , 3 r e s i s i t a

15、 n t t o b a c c o p l a n t s t r a n s f o r m e d w i t h e x p r e s s i o n v e c t o rP —P G H N B S —G r o E L a n dP ·S U C 2 - G r o E L ，s e p a r a t e l y ．V i a t w i c e i n o c u l a t e d e x p e r i

16、 m e n t ，c o m p a r i n g w i t hC a M V 3 5p r o m o t e r ，i tW a s o b v i o u s t h a tt r a n s g e n i ct o b a c c ow i t hP G H N B Sa n d S U E 2 p r o m o t e r se x p r e s s e d m o r e r e s i s t a n c et

17、 o w a r d T Y L C V ．3 ．T h eA C 1 a n dt h eA C 2 r e p e a ts e g m e n to f t h eT Y L C V w a s c l o n e d a n dt h es e n s es e g m e n t ，i n t r o n a n dt h e a n t i s e n s es e g m e n tw e r ec o n s t r u

18、 c t e di n t op l a n t e x p r e s s i o n v e c t o rp B I 12 1 b y u s i n g a s e r i e so f c l o n i n g m e t h o d s ．T h e v e c t o r h a s a r e v e r s er e p e a t e ds e q u e n c ea saf o r e i g ns e g m