不同啟動(dòng)子及其組合在水稻懸浮細(xì)胞中驅(qū)動(dòng)外源基因的表達(dá)分析.pdf

1、啟動(dòng)子是基因表達(dá)調(diào)控的重要順式作用元件，對(duì)于目的基因的表達(dá)至關(guān)重要。在基因工程的研究和應(yīng)用中，選用合適的啟動(dòng)子對(duì)于外源基因的高效表達(dá)具有重要意義。植物懸浮細(xì)胞系是研究細(xì)胞分化、代謝、死亡等問題的重要材料。因此，研究適用于植物懸浮細(xì)胞系的啟動(dòng)子，對(duì)于如何提高表達(dá)量、防止蛋白降解和如何實(shí)現(xiàn)高效、可誘導(dǎo)、定向表達(dá)具有重要意義。因?yàn)榫G色熒光蛋白(GFP)具有檢測(cè)方便、熒光穩(wěn)定、無(wú)毒害、易于構(gòu)建、共用性和通用性等特點(diǎn)，現(xiàn)在已經(jīng)成為分子生物學(xué)中最常

2、用的報(bào)告基因之一。
　　本研究以日本晴粳稻懸浮細(xì)胞系為材料，以常用的花椰菜花葉病毒(CaMV)35S啟動(dòng)子為對(duì)照，通過PCR的方法在植物基因組DNA中擴(kuò)增得到玉米泛素蛋白啟動(dòng)子(Ubi)、水稻肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子(Actin)以及水稻Oscc1啟動(dòng)子，通過單個(gè)啟動(dòng)子和串聯(lián)啟動(dòng)子的方式，構(gòu)建了10個(gè)含有GFP報(bào)告基因的植物表達(dá)載體:pCAMBIA130435S-GFP、Ubi-GFP、Actin-GFP、Oscc1-GFP、35S/Ubi

3、-GFP、35S/Actin-GFP、35S/Oscc1-GFP、Ubi/Actin-GFP、Ubi/Oscc1-GFP、Actin/Oscc1-GFP。同時(shí)采用根瘤農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法，將10個(gè)攜帶有GFP報(bào)告基因的植物表達(dá)載體導(dǎo)入日本晴水稻懸浮細(xì)胞，經(jīng)懸浮培養(yǎng)得到轉(zhuǎn)基因的日本晴懸浮細(xì)胞系。最后利用熒光顯微鏡、熒光酶標(biāo)儀檢測(cè)GFP熒光強(qiáng)度，通過免疫印跡分析(western blot)檢測(cè)GFP蛋白的表達(dá)水平，研究不同啟動(dòng)子組合在日本晴水稻

4、懸浮細(xì)胞中驅(qū)動(dòng)外源基因表達(dá)的差異。本研究旨在通過基因工程的手段優(yōu)化啟動(dòng)子組合，為在日本晴水稻懸浮細(xì)胞中高效表達(dá)外源基因奠定基礎(chǔ)。
　　研究結(jié)果表明，PCR鑒定結(jié)果顯示得到了10種轉(zhuǎn)基因日本晴水稻懸浮細(xì)胞系。在熒光顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，野生型日本晴水稻懸浮細(xì)胞（作為對(duì)照）幾乎沒有綠色熒光，其他的轉(zhuǎn)基因日本晴水稻懸浮細(xì)胞均有綠色熒光，證明GFP在不同啟動(dòng)子的驅(qū)動(dòng)下均有表達(dá)，而且雙元啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的GFP熒光強(qiáng)度要強(qiáng)于單個(gè)啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的GFP熒光

5、強(qiáng)度。通過熒光酶標(biāo)儀定量檢測(cè)GFP熒光強(qiáng)度發(fā)現(xiàn)，GFP在pCAMBIA1304-Ubi/Oscc1中熒光值最高，在野生型中最低。雙元啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的GFP的表達(dá)強(qiáng)度是單個(gè)啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)GFP的表達(dá)強(qiáng)度的2-4倍。三種雙元啟動(dòng)子(pCAMBIA1304-Ubi/Oscc1、pCAMBIA1304-CaMV35S/Ubi、pCAMBIA1304-Ubi/Actin)驅(qū)動(dòng)的GFP的表達(dá)強(qiáng)度是四種單個(gè)啟動(dòng)子(pCAMBIA1304-Ubi、pCAMBI

6、A1304-Oscc1、pCAMBIA1304-Actin、pCAMBIA1304-CaMV35S）驅(qū)動(dòng)的GFP的表達(dá)強(qiáng)度的3倍。通過western blot檢測(cè)GFP蛋白的表達(dá)水平發(fā)現(xiàn)，野生型日本晴水稻懸浮細(xì)胞沒有GFP蛋白表達(dá)條帶，其他轉(zhuǎn)基因日本晴水稻懸浮細(xì)胞均有大小約為26.9 kDa的GFP蛋白表達(dá)條帶。通過免疫印跡條帶灰度分析發(fā)現(xiàn)pCAMBIA1304-Ubi/Oscc1、pCAMBIA1304-CaMV35S/Ubi、pCA

7、MBIA1304-Ubi/Actin表達(dá)量相比于其他其他組合要高。western blot的試驗(yàn)結(jié)果與熒光顯微鏡和酶標(biāo)儀檢測(cè)GFP熒光表達(dá)強(qiáng)度結(jié)果基本一致，從而我們可以選出優(yōu)化的啟動(dòng)子組合。以上結(jié)果表明，pCAMBIA1304-Ubi/Oscc1、pCAMBIA1304-CaMV35 S/Ubi、pCAMBIA1304-Ubi/Actin三種啟動(dòng)子組合能較強(qiáng)驅(qū)動(dòng)GFP的表達(dá)，Ubi啟動(dòng)子更適合驅(qū)動(dòng)外源基因在日本晴水稻懸浮細(xì)胞中的高效表達(dá)