油菜BnMKK4基因的克隆、表達(dá)分析及其啟動(dòng)子的分離和活性研究.pdf

1、植物生長(zhǎng)發(fā)育過程中,常常受到外界環(huán)境脅迫的影響,而植物在長(zhǎng)期的進(jìn)化過程中形成了完整的防御機(jī)制用以抵御各種環(huán)境脅迫。植物體內(nèi)存在的促分裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinase, MAPK)途徑在植物應(yīng)對(duì)生物和非生物脅迫的過程中發(fā)揮重要作用。MAPK途徑存在于所有真核細(xì)胞中,其有三個(gè)組成成分:MAPK,MAPKK和MAPKKK,它們按照MAPKKK→MAPKK→MAPK的方式依次磷酸化把胞外刺激傳遞

2、至細(xì)胞內(nèi)。在MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中,MAPKKs接受來自MAPKKKs的信號(hào)并對(duì)信息進(jìn)行整合,之后將這些信號(hào)傳遞至下游的MAPKs。因此研究油菜中的MKKs有利于探究其抗逆信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制。組成型啟動(dòng)子在植物基因工程中廣泛應(yīng)用,但是組成型啟動(dòng)子不能對(duì)目的基因的表達(dá)進(jìn)行時(shí)間和空間上的有效調(diào)控。因此研究誘導(dǎo)型啟動(dòng)子非常重要。近年來,從植物中分離得到大量的MAPKKs,但是關(guān)于油菜MAPKKs的研究相對(duì)較少。本研究從油菜中分離得到一個(gè)C類MAPK

3、K基因,命名為BnMKK4,對(duì)該基因及其啟動(dòng)子做了初步研究。
　　本研究主要內(nèi)容包括：⑴從油菜中分離得到一個(gè)新的MAPKK基因 BnMKK4(GenBank登錄號(hào)為JF268686)。序列分析顯示:該基因全長(zhǎng)1317 bp,其開放閱讀框編碼330個(gè)氨基酸;預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的分子量為36.5 kDa,等電點(diǎn)為9.01,并且為含有多個(gè)磷酸化位點(diǎn)的親水性蛋白;預(yù)測(cè)蛋白的高級(jí)結(jié)構(gòu)富含α-螺旋和不規(guī)則卷曲。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析結(jié)果顯示其為C類MAPKK

4、。⑵實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示:BnMKK4基因在兩種油菜的莖、葉、下胚軸中均有表達(dá),并且在葉中的表達(dá)量最高,低溫處理下,隴油6號(hào)油菜莖、葉、下胚軸中的BnMKK4基因的表達(dá)量均升高,而天油2號(hào)油菜僅葉片中該基因的表達(dá)量增加;在低溫處理下,隴油6號(hào)油菜葉片中BnMKK4基因的表達(dá)量持續(xù)上升,而天油2號(hào)油菜葉片中該基因的表達(dá)量先上升后下降;高鹽脅迫下,兩種油菜葉片中BnMKK4基因的表達(dá)量均呈現(xiàn)出先升高后降低的趨勢(shì),但與天油2號(hào)相比,隴油

5、6號(hào)下降緩慢。結(jié)果表明BnMKK4可能參與調(diào)控油菜低溫和高鹽脅迫,并且隴油6號(hào)油菜的抗逆性可能更強(qiáng)。⑶構(gòu)建pBI121-BnMKK4-GFP表達(dá)載體,在洋蔥表皮細(xì)胞中進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá),激光共聚焦熒光顯微鏡下觀察綠色熒光位于細(xì)胞核,說明BnMKK4定位于細(xì)胞核。⑷從隴油6號(hào)油菜中克隆得到BnMKK4基因ATG上游的999bp序列,分析發(fā)現(xiàn)該序列含有與低溫、干旱、ABA脅迫誘導(dǎo)相關(guān)的順勢(shì)作用元件,說明該啟動(dòng)子可能受低溫、干旱和ABA脅迫的誘導(dǎo)。

6、⑸將5’端缺失啟動(dòng)子片段構(gòu)建到pCAMBIA1302載體,與報(bào)告基因GFP融合,通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)化洋蔥表皮細(xì)胞,激光共聚焦熒光顯微鏡下觀察綠色熒光的強(qiáng)度,結(jié)果表明BnMKK4啟動(dòng)子活性的核心結(jié)構(gòu)位于ATG上游-416~-271bp之間。⑹將BnMKK4啟動(dòng)子與GFP融合,利用洋蔥瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)研究溫度和鹽脅迫下該啟動(dòng)子的活性,結(jié)果表明該啟動(dòng)子可能是低溫和高鹽誘導(dǎo)的啟動(dòng)子。⑺UV-B脅迫下,在一定的脅迫時(shí)間內(nèi)兩種油菜抗氧化酶系統(tǒng)中