油菜莖特異啟動(dòng)子pSH4的克隆和分析及轉(zhuǎn)基因作物篩查質(zhì)粒的構(gòu)建.pdf

1、啟動(dòng)子在基因表達(dá)調(diào)控中起關(guān)鍵性作用，它在很大程度上決定目的基因表達(dá)的時(shí)間、空間和強(qiáng)度。當(dāng)前商業(yè)化應(yīng)用的植物基因工程產(chǎn)品大多使用的是組成型啟動(dòng)子，它們驅(qū)動(dòng)外源基因在植物各種組織和所有發(fā)育階段表達(dá)，這無(wú)疑增加了植物的代謝負(fù)擔(dān)導(dǎo)致物質(zhì)和能量的浪費(fèi)，另外可能引起影響植物生長(zhǎng)發(fā)育的植物形態(tài)改變，并且組成型表達(dá)的篩選標(biāo)記基因不利于轉(zhuǎn)基因安全。因此克隆組織特異表達(dá)啟動(dòng)子對(duì)于提高轉(zhuǎn)基因效率及增加轉(zhuǎn)基因安全性有著重要的意義。油菜中目前研究最多的是種子表達(dá)

2、啟動(dòng)子，已經(jīng)克隆了多個(gè)種子特異啟動(dòng)子，而對(duì)油菜營(yíng)養(yǎng)器官啟動(dòng)子研究較少。本研究從油菜基因組中克隆莖部特異性表達(dá)基因啟動(dòng)子pSH4，并與GFP報(bào)告基因融合，轉(zhuǎn)化擬南芥后對(duì)其進(jìn)行功能的初步驗(yàn)證，該研究的結(jié)果可以為油菜莖的基因特異表達(dá)提供有價(jià)值的啟動(dòng)子。本研究的主要研究結(jié)果包括以下幾個(gè)方面：
　　 1、通過(guò)篩選擬南芥組織特異表達(dá)基因，篩選獲得6個(gè)莖特異表達(dá)基因。
　　 2、用甘藍(lán)型油菜中雙9號(hào)為材料，在盛花期取其根、莖、葉、花器

3、官等，提取RNA進(jìn)行啟動(dòng)子的各器官表達(dá)相對(duì)強(qiáng)度進(jìn)行分析。結(jié)果顯示候選基因SH4呈在莖中特異性表達(dá)。
　　 3、檢索白菜基因組測(cè)序序列，獲得油菜SH4啟動(dòng)子的序列，設(shè)計(jì)引物克隆了油菜莖特異性啟動(dòng)子pSH4，長(zhǎng)度1779bp。生物信息學(xué)分析顯示其具有多種順式作用元件，包括參與莖組織特異性表達(dá)的元件如CCA1ATLHCB1、DOFCOREZM等，激素誘導(dǎo)相關(guān)元件ASF1MOTIFCAMV、LTRECOREATCOR15等，以及物理因素

4、誘導(dǎo)的相關(guān)元件GT1CORE、GT1CONSENSUS等。
　　 4、為進(jìn)一步驗(yàn)證SH4的功能，成功構(gòu)建2個(gè)植物表達(dá)載體：pBI121-SH4-GFP，攜帶pSH4啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)GFP基因的表達(dá)盒，由農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化擬南芥，獲得轉(zhuǎn)基因植株，觀察T1代植株的GFP的表達(dá)情況，結(jié)果表明pSH4啟動(dòng)子具有維管束組織表達(dá)特異性，是理想的莖表達(dá)啟動(dòng)子。
　　 本研究對(duì)pSH4啟動(dòng)子的分離和組織特異性及其序列特征的生物信息學(xué)、表達(dá)分布等方

5、面的分析，為深入研究和利用該啟動(dòng)子提供了試驗(yàn)依據(jù)和理論基礎(chǔ)。
　　 另外，本研究構(gòu)建一種轉(zhuǎn)基因作物通用陽(yáng)性質(zhì)粒分子，為轉(zhuǎn)基因生物篩查檢測(cè)和安全監(jiān)管服務(wù)。通過(guò)分析全球商業(yè)化種植的轉(zhuǎn)基因作物分子特征，選取常用的調(diào)控元件啟動(dòng)子CaMV 35S、FMV35S、nos，終止子NOS 3'、T-35S、g7 3'、E9 3'，和標(biāo)記基因bar、 NPT II、hpt II、pmi作為篩查靶標(biāo)序列，通過(guò)重組PCR技術(shù)將這些元件克隆到雙元載體p

6、BI121上，構(gòu)建成包含11個(gè)轉(zhuǎn)基因元件的通用陽(yáng)性質(zhì)粒分子pBI121-ELEMENTS。質(zhì)粒序列信息已提交至GeneBank并獲得序列號(hào)HM047294。該質(zhì)粒分子對(duì)目前國(guó)內(nèi)外批準(zhǔn)的5類(lèi)主要轉(zhuǎn)基因作物(大豆、油菜、玉米、棉花和水稻)理論篩查覆蓋率達(dá)到91.5[％]，對(duì)我國(guó)批準(zhǔn)進(jìn)口的27種轉(zhuǎn)基因作物的理論篩查覆蓋率達(dá)100[％]。以pBI121-ELEMENTS為陽(yáng)性對(duì)照，篩查7個(gè)轉(zhuǎn)基因品系，結(jié)果顯示該分子能夠有效用于轉(zhuǎn)基因作物定性篩查