油菜缺磷誘導(dǎo)表達(dá)基因BnSPX3和BnIPS1及其啟動子的分離與鑒定.pdf

1、磷是植物生長發(fā)育必需的營養(yǎng)元素。由于土壤中磷很容易被吸附固定，所以土壤中磷的生物有效性很低，缺磷成為限制作物產(chǎn)量的重要因素。植物通過生理生化和形態(tài)發(fā)育的變化來應(yīng)對缺磷脅迫，這些變化的產(chǎn)生涉及大量基因的誘導(dǎo)表達(dá)。目前已經(jīng)在一些物種中分離鑒定了很多缺磷誘導(dǎo)表達(dá)基因。油菜是我國主要的油料作物，需磷較多，對缺磷敏感。為了探究甘藍(lán)型油菜應(yīng)對缺磷脅迫的分子反應(yīng)和機(jī)制，我們分離了8個甘藍(lán)型油菜缺磷誘導(dǎo)表達(dá)基因。對其中的SPX結(jié)構(gòu)域基因BnSPX3和T

2、PSI1/Mt4家族基因BnIPS1及其啟動子進(jìn)行了深入研究。主要結(jié)果如下：
　　 1.利用擬南芥的基因信息，通過同源序列法從甘藍(lán)型油菜中分離了8個缺磷誘導(dǎo)表達(dá)基因，它們包括磷酸酶、硫脂合酶、單半乳糖甘油二脂合酶、SPX和TPSI1/Mt4家族基因以及功能未知基因。
　　 2.BnSPX3在甘藍(lán)型油菜中至少包括兩個同源基因，BnSPX3；1和BnSPX3；2。二者的cDNA全長分別是936和863 bp，具有95%的核苷

3、酸相似性；二者具有相同的基因結(jié)構(gòu)：三個外顯子和兩個內(nèi)含子；二者的開放讀碼框(ORF)分別長741和720bp，編碼246和239個氨基酸的蛋白質(zhì)，這兩個蛋白質(zhì)只含有SPX保守結(jié)構(gòu)域。進(jìn)化分析表明BnSPX3；1和BnSPX3；2分別來自白菜和甘藍(lán)基因組，并且二者的序列分化要早于甘藍(lán)型油菜的形成?；虮磉_(dá)分析顯示BnSPX3；1和BnSPX3；2受缺磷特異誘導(dǎo)表達(dá)，并且誘導(dǎo)具有持續(xù)性和可逆性。
　　 3.通過同源序列法分離了BnS

4、PX3；1和BnSPX3；2的啟動子，分別位于轉(zhuǎn)錄起始位點上游1742和1874 bp。兩個啟動子除了含有TATA box和YPatch等核心啟動子元件外，還含有PIBS和PHO等參與缺磷誘導(dǎo)表達(dá)基因調(diào)控的順式作用元件。分別將BnSPX3；1啟動子(-1742/+21)和BnSPX3；2啟動子(-1874/+140)與報告基因GUS融合，構(gòu)建重組表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化擬南芥。T3代純合轉(zhuǎn)基因植株GUS染色表明，兩個啟動子只在缺磷條件下表現(xiàn)出活性

5、，并且根中的活性要遠(yuǎn)高于葉中。進(jìn)一步對BnSPX3；2啟動子(-1874/+140)進(jìn)行缺失分析，結(jié)果表明，-1568至-1153，-746至-327，-326至-167，-166至-60之間的區(qū)段對缺磷條件下啟動子活性有很(極)大影響，是BnSPX3；2啟動子響應(yīng)缺磷的主要調(diào)控區(qū)域；其中-746至-327之間可能存在全新的響應(yīng)缺磷的順式作用元件。將PBnSPX3；2：GUS融合基因轉(zhuǎn)入AtPHR1突變體phr1中，野生型背景轉(zhuǎn)基因植株

6、的GUS的表達(dá)量顯著高于phr1背景植株，說明BnSPX3；2啟動子受轉(zhuǎn)錄因子AtPHR1調(diào)控。
　　 4.BnIPS1在甘藍(lán)型油菜中至少包括兩個同源基因，BnIPS1；1和BnIPS1；2。二者的cDNA全長分別是592和557 bp，具有91%的核苷酸相似性，并且含有一段保守序列，與miR399互補(bǔ)。基因結(jié)構(gòu)分析顯示這兩個基因都沒有內(nèi)含子。BnIPS1；1可能含有兩個短的開放讀碼框(ORF)，BnIPS1；2沒有開放讀碼框。

7、進(jìn)化分析表明BnIPS1；1和BnIPS1；2分別來自白菜基因組和甘藍(lán)基因組。基因表達(dá)分析顯示BnIPS1；1和BnIPS1；2不僅受缺磷誘導(dǎo)表達(dá)，而且受滲透脅迫和鹽害誘導(dǎo)表達(dá)，但缺磷的誘導(dǎo)程度要強(qiáng)于其它脅迫。并且二者的缺磷誘導(dǎo)表達(dá)具有快速、持續(xù)和可逆的特點。
　　 5.通過同源序列法分離了BnIPS1；1和BnIPS1；2的啟動子，分別位于轉(zhuǎn)錄起始位點上游1977和2093 bp。兩個啟動子屬于典型的TATA盒型啟動子元件，分

8、別含有3和4個PIBS元件。將BnIPS1；1啟動子(-1459/+42)與報告基因GUS融合，構(gòu)建重組表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化擬南芥。T3代純合轉(zhuǎn)基因植株GUS染色表明，BnIPS1；1啟動子只在缺磷條件下表現(xiàn)出活性。
　　 綜上所述，SPX和TPSI1/Mt4家族基因，BnSPX3和BnIPS1，及其啟動子的分離和鑒定在油菜中屬于首次報道。其中基因BnSPX3可以作為研究油菜缺磷誘導(dǎo)基因表達(dá)調(diào)控的載體和判斷油菜磷缺乏狀況的理想標(biāo)記基因