大豆硫苷代謝功能基因GmSOT1的遺傳轉(zhuǎn)化與功能鑒定.pdf

1、大豆[Glycine max(L.)]，雙子葉植物綱豆科大豆屬植物，為重要的糧油兼用作物。隨著全球氣候變化和農(nóng)藥過(guò)度的使用，大豆生產(chǎn)中病蟲(chóng)害日益加重。為了從源頭尋找理想的大豆抗病蟲(chóng)相關(guān)基因，培育抗病蟲(chóng)大豆新品種，我們開(kāi)展了大豆次生代謝相關(guān)的抗病蟲(chóng)害基因的挖掘工作。硫代葡萄糖苷（Glucosinolate，簡(jiǎn)稱(chēng)硫苷）是一種于十字花科植物中發(fā)現(xiàn)的次生代謝產(chǎn)物，其水解產(chǎn)物具有抑制細(xì)菌、真菌增殖和抗蟲(chóng)等功能。而關(guān)于大豆中硫苷抗病蟲(chóng)功能的相關(guān)研究

2、報(bào)道甚少。本實(shí)驗(yàn)室前期的研究發(fā)現(xiàn)，在大豆根瘤中存在硫苷代謝途徑，并首次從大豆根瘤中克隆出硫苷代謝途徑中的關(guān)鍵酶基因—磺酸基轉(zhuǎn)移酶基因GmSOT1。而GmSOT1基因的過(guò)表達(dá)是否會(huì)增加大豆植株中的硫苷含量從而提高其抗病蟲(chóng)的能力則尚未見(jiàn)報(bào)道。
　　雖然轉(zhuǎn)基因大豆已在全球范圍大面積種植，但其遺傳轉(zhuǎn)化仍是具體實(shí)施的難點(diǎn)。盡管從理論上利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將外源基因轉(zhuǎn)入大豆可縮短大豆良種選育進(jìn)程，然而目前大豆的遺傳轉(zhuǎn)化效率仍極低，主要原因歸咎為:

3、1）大豆離體培養(yǎng)植株再生困難;2)實(shí)驗(yàn)操作重復(fù)性差;3）受體基因型間差異明顯和轉(zhuǎn)入基因的依賴(lài)性強(qiáng);4）培養(yǎng)條件復(fù)雜，這極大程度地桎梏了利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)進(jìn)行的大豆遺傳改良。因此，建立一種高效的大豆離體培養(yǎng)再生體系，并在此基礎(chǔ)上優(yōu)化農(nóng)桿菌介導(dǎo)的大豆遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)，是目前大豆遺傳轉(zhuǎn)化中亟待解決的一個(gè)難題。
　　本研究以大豆K06-82胚尖為起始外植體，開(kāi)展了大豆高效離體培養(yǎng)再生體系的優(yōu)化，對(duì)以大豆胚尖為受體系統(tǒng)的遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)進(jìn)行了改良，并進(jìn)

4、行了大豆GmSOT1的遺傳轉(zhuǎn)化，然后利用GUS染色、PCR檢測(cè)、Southern blot雜交等方法對(duì)轉(zhuǎn)GmSOT1基因的抗性植株進(jìn)行了分析;初步鑒定了GmSOT1基因轉(zhuǎn)基因植株的抗蟲(chóng)效果，同時(shí)測(cè)定了GmSOT1基因轉(zhuǎn)基因植株的酶活水平，試驗(yàn)結(jié)果如下:
　　1.建立了大豆K06-82的高效、穩(wěn)定再生體系:以氯氣消毒法獲取外植體胚尖，以MSB5為基本培養(yǎng)基，不定芽誘導(dǎo)時(shí)先在附加3.0mg/L6-芐氨基腺嘌呤(6-BA)的培養(yǎng)基上光下

5、培養(yǎng)5d，再轉(zhuǎn)接至附加0.5mg/L6-BA和0.05mg/L萘乙酸(NAA)的培養(yǎng)基上，2W繼代一次;不定芽伸長(zhǎng)培養(yǎng)基配方為:MSB5+0.2mg/L6-BA+0.3mg/L赤霉素(GA3)，2W繼代一次;不定芽生根時(shí)培養(yǎng)基配方為:1/2MSB5+1.0mg/L吲哚丁酸(IBA)，該方法適用于帶胚軸不定芽和不帶胚軸不定芽生根，生根效率均達(dá)到96.7％左右。
　　2.大豆遺傳轉(zhuǎn)化體系優(yōu)化:對(duì)K06-82胚尖進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化時(shí)，預(yù)培養(yǎng)時(shí)

6、間以24 h為宜，最佳侵染方法是28℃、200r/min條件下侵染1h，共培養(yǎng)時(shí)乙酰丁香酮(AS)使用濃度為200μmol/L，適合大豆K06-82轉(zhuǎn)基因抗性芽生根的IBA濃度為1.2mg/L，不帶下胚軸的不定芽生根率高于攜帶下胚軸的不定芽生根率。隨后用優(yōu)化的遺傳轉(zhuǎn)化方法將GmSOT1基因轉(zhuǎn)入K06-82胚尖，遺傳轉(zhuǎn)化效率達(dá)25.1％。
　　3.大豆GmSOT1抗性植株的分子鑒定和抗蟲(chóng)性測(cè)試:利用GUS染色和PCR檢測(cè)方法，初步證