甘菊NAC基因的功能研究及對露地菊花的遺傳轉(zhuǎn)化.pdf

1、植物NAC轉(zhuǎn)錄因子是植物中所特有的一類轉(zhuǎn)錄因子，參與植物基因多種途徑的表達(dá)調(diào)控，在植物對外界的生物與非生物的脅迫應(yīng)答中起到關(guān)鍵的調(diào)控作用。菊花是中國傳統(tǒng)名花，品種繁多，但在逆境如低溫、干旱、鹽堿等脅迫下，往往限制了其生長和觀賞價值。因此培育抗逆性強(qiáng)的菊花新品種非常必要，但由于復(fù)雜的遺傳背景，使菊花的抗逆性研究進(jìn)展緩慢。甘菊[Chrysanthemum lavandulifolium(Fisch.ex Trautv.) Makino]是菊

2、科菊屬的二倍體植物，遺傳背景簡單，且具有較強(qiáng)的耐鹽堿能力。本試驗從甘菊中分離了2個NAC轉(zhuǎn)錄因子基因的cDNA全長，并對該基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析與表達(dá)模式分析，并轉(zhuǎn)入擬南芥中對其功能進(jìn)行分析，以此來探討甘菊中NAC轉(zhuǎn)錄因子基因的表達(dá)模式與功能，然后將該基因轉(zhuǎn)入菊花品種----露地菊‘紐9717’中，進(jìn)一步研究甘菊NAC基因的功能，以期能了解甘菊中NAC轉(zhuǎn)錄因子的作用機(jī)制及為培育抗逆性強(qiáng)的菊花新品系提供理論基礎(chǔ)。主要研究結(jié)果如下:

3、　　1.在課題組前期構(gòu)建的甘菊轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中搜索NAC轉(zhuǎn)錄因子基因的ESTs，采用RACE技術(shù)分別擴(kuò)增得到全長為881bp和1188bp的甘菊NAC基因cDNA序列ClNAC9和ClNAC39;其中ClNAC9具有一個651bp的ORF，編碼217個氨基酸殘基;ClNAC39基因具有一個849bp的ORF，編碼283個氨基酸。保守結(jié)構(gòu)域檢索及氨基酸序列比對結(jié)果顯示，這2個基因都具NAM結(jié)構(gòu)域，是NAC轉(zhuǎn)錄因子家族的成員，其中ClNAC9

4、基因?qū)儆赟ENU5亞家族;ClNAC39基因?qū)儆贜AP亞家族，二者都是疏水性蛋白質(zhì)。
　　2.采用qRT-PCR分析ClNAC在不同非生物脅迫和激素處理的表達(dá)模式。結(jié)果表明:ClNAC9基因受高鹽、干旱、熱、ABA脅迫的誘導(dǎo)，不受冷及水楊酸脅迫誘導(dǎo);ClNAC39基因受高鹽、干旱、熱、ABA及水楊酸的脅迫誘導(dǎo)，只不受冷誘導(dǎo)。從基因表達(dá)量變化峰值上，ClNAC9基因相對表達(dá)量明顯高于ClNA3C9。
　　3.構(gòu)建植物表達(dá)載體p

5、BI121-ClNAC9和pBI121-ClNAC39，采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)方法轉(zhuǎn)化擬南芥(Col-0)，經(jīng)卡那霉素抗性篩選及RT-PCR鑒定轉(zhuǎn)基因陽性苗。在NaCl、NaHCO3及干旱三種脅迫下兩種轉(zhuǎn)基因植株在表型明顯優(yōu)于野生型;轉(zhuǎn)基因植株的MDA含量都低于野生型植株，SOD、POD活力都高于野生型植株。實(shí)時定量PCR分析表明轉(zhuǎn)ClNAC9及ClNAC39基因的擬南芥能夠響應(yīng)鹽堿和干旱的脅迫，誘導(dǎo)下游與脅迫相關(guān)抗性基因表達(dá)，增強(qiáng)了轉(zhuǎn)基因植株

6、的抗逆性。同時轉(zhuǎn)ClNAC9基因的擬南芥在表現(xiàn)及生理指標(biāo)上都優(yōu)于轉(zhuǎn)ClNAC39基因的擬南芥。
　　4.以露地菊‘紐9717’腋芽為外植體，建立其初始培養(yǎng)。通過研究各階段影響再生諸因素的作用，建立了露地菊‘紐9717’腋芽增殖和葉盤愈傷組織再生兩種途徑的再生體系。腋芽增值系數(shù)達(dá)到3.2，愈傷組織誘導(dǎo)率達(dá)100％，分化率達(dá)92.％以上，生根率為100％，為露地菊‘紐9717’遺傳轉(zhuǎn)化建立的了高效穩(wěn)定的葉盤再生體系。
　　5.通

7、過根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)，建立了高效的露地菊‘紐9717’遺傳轉(zhuǎn)化體系:卡那霉素濃度10mg/L為葉片最佳的抗生素篩選濃度、8mg/L為轉(zhuǎn)化苗生根的最佳選擇壓力;葉片預(yù)培養(yǎng)時間為2-3d;菌液濃度為OD600為0.6左右;侵染時間為15min或OD600為0.8侵染10min;共培養(yǎng)時間為2d，延遲培養(yǎng)3d。經(jīng)PCR檢測，得到了轉(zhuǎn)ClNAC9基因的露地菊‘紐9717’植株15株及轉(zhuǎn)ClNAC39基因的露地菊‘紐9717’植株4株。經(jīng)RT-PCR