大豆GmNHX1基因的功能分析及遺傳轉(zhuǎn)化研究.pdf

1、大豆[Glycine max(L.)Merrill]是我國(guó)主要的糧食作物和油料作物，但土壤鹽漬化成為影響大豆生長(zhǎng)和產(chǎn)量的主要限制因素之一。近年來(lái)，基因工程技術(shù)被廣泛應(yīng)用于提高植物的耐鹽性，將抗逆基因?qū)雰?yōu)良大豆品種，培育抗逆高產(chǎn)新品系，為解決這一問(wèn)題提供了新途徑。目前已有多個(gè)耐鹽相關(guān)基因應(yīng)用于植物抗逆研究，其中Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因家族研究較為深入，其主要作用是通過(guò)將細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的Na+外排到胞外或者將Na+區(qū)隔化到液泡中，來(lái)維持細(xì)胞

2、內(nèi)的Na+穩(wěn)態(tài)和Na+/K+比相對(duì)穩(wěn)定，從而減少鹽脅迫對(duì)植株造成的傷害。但有關(guān)大豆Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的生物學(xué)功能分析以及應(yīng)用的研究還很少。本研究以超表達(dá)GmNHX1基因的擬南芥及酵母nhx1缺失突變體為材料，通過(guò)非損傷微測(cè)技術(shù)、real-time PCR以及酵母互補(bǔ)試驗(yàn)，驗(yàn)證GmNHX1基因的耐鹽功能;借助基因槍法轉(zhuǎn)化洋蔥，觀察GmNHX1蛋白的亞細(xì)胞定位。在此基礎(chǔ)上，利用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的大豆子葉節(jié)轉(zhuǎn)化法進(jìn)行GmNHX1基因的

3、遺傳轉(zhuǎn)化。結(jié)果如下:
　　1、超表達(dá)GmNHX1擬南芥T3代純合體的鑒定。對(duì)抗生素篩選得到的3個(gè)純合體株系進(jìn)行Southern Blotting檢測(cè)，證明3個(gè)株系均為單拷貝。RT-PCR分析結(jié)果表明超表達(dá)擬南芥植株葉片中GmNHX1的表達(dá)量明顯高于根中。
　　2、超表達(dá)GmNHX1擬南芥耐鹽性鑒定。在萌發(fā)期，經(jīng)0-150 mmol/L NaCl脅迫下，三個(gè)轉(zhuǎn)基因株系均比野生型有較長(zhǎng)的主根，發(fā)育較好;在萌發(fā)后的生長(zhǎng)期，株系OE

4、1-1在150 mmol/L NaCl脅迫下比野生型有較長(zhǎng)的主根，長(zhǎng)勢(shì)更好;在成苗期，經(jīng)170 mmol/L NaCl處理三周后，三個(gè)超表達(dá)株系生長(zhǎng)狀況明顯優(yōu)于野生型，其干重、鮮重、蓮座葉和株高均優(yōu)于后者。表明超表達(dá)GmNHX1基因的擬南芥植株耐鹽性明顯高于野生型植株。
　　3、構(gòu)建pYES2-GmNHX1酵母表達(dá)載體，利用鹽敏感酵母突變體菌株YDR456W和AXT3，進(jìn)行功能互補(bǔ)試驗(yàn)。在50及200 mmol/L NaCl處理下

5、，轉(zhuǎn)GmNHX1基因的酵母突變體菌株生長(zhǎng)速度快于對(duì)照，能夠恢復(fù)酵母突變體的耐鹽性。
　　4、構(gòu)建pCAMBIA3301-35S∷GmNHX1-GFP亞細(xì)胞定位載體，利用基因槍法轟擊洋蔥內(nèi)表皮細(xì)胞，熒光顯微鏡觀察結(jié)果表明該蛋白主要分布于液泡膜上。
　　5、大豆GmNHX1基因耐鹽機(jī)制分析。經(jīng)170 mmol/L NaCl鹽處理兩周后，轉(zhuǎn)基因擬南芥植株葉片中K+和Na+含量均比野生型有顯著增加;而在根中，轉(zhuǎn)基因植株K+含量增加，

6、Na+含量降低。非損傷微測(cè)技術(shù)(NMT)結(jié)果表明，鹽處理后OE1-1的Na+外排速率顯著大于野生型;利用BCECF-AM染料標(biāo)記H+，熒光顯微鏡觀察幼根中H+含量變化，結(jié)果表明，鹽處理后OE1-1能維持較高的pH值;相關(guān)耐鹽基因表達(dá)模式分析結(jié)果表明，鹽處理后超表達(dá)GmNHX1主要影響AtSKOR和AtSOS1基因的上調(diào)表達(dá)。
　　6、利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的大豆子葉節(jié)遺傳轉(zhuǎn)化體系，將GmNHX1基因?qū)臌}敏感品種五星2號(hào)，經(jīng)除草劑篩選以及