玉米根系蛋白磷酸酶基因ZmPP2C功能分析及遺傳轉(zhuǎn)化研究.pdf

1、ZmPP2C(AY621066)是本實(shí)驗(yàn)室從玉米根系中分離的一個(gè)蛋白磷酸酶基因,其編碼區(qū)長度為873 bp,編碼含有290個(gè)氨基酸殘基的蛋白質(zhì)。為了研究ZmPP2C功能,我們首先將ZmPP2C與GFP在洋蔥表皮內(nèi)融合表達(dá),發(fā)現(xiàn)該基因是在核內(nèi)表達(dá)；然后又利用花序浸染法轉(zhuǎn)化擬南芥,通過基因組PCR、半定量RT-PCR以及Western blot分析證實(shí),該基因已經(jīng)成功轉(zhuǎn)入擬南芥染色體中并在蛋白質(zhì)水平上表達(dá)。我們對(duì)獲得的T3代轉(zhuǎn)基因擬南芥純合

2、體,在逆境脅迫處理下,進(jìn)行種子萌發(fā)、根的伸長以及各種生理指標(biāo)的測定。并將該基因成功轉(zhuǎn)化玉米。主要結(jié)果如下： 1.玉米中ZmPP2C基因與擬南芥等其他植物中的同源性比較 利用Invitrogen軟件包中的alignX軟件,對(duì)分別來自于所有擬南芥中蛋白磷酸酶,以及與擬南芥、玉米、大麥、水稻、苜蓿等已經(jīng)研究過的PP2C蛋白進(jìn)行了分子聚類分析,分別構(gòu)建了ZmPP2C蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹。進(jìn)化樹分析表明,ZmPP2C與冰葉日中花植物中

3、的MPC9同源性較高。與擬南芥中PP2C類蛋白的F類同源性較高。 2.玉米ZmPP2C基因的表達(dá)分析 對(duì)玉米幼苗進(jìn)行甘露醇模擬干旱和高鹽脅迫處理,提取根系總RNA進(jìn)行Northern雜交,結(jié)果表明,干旱和高鹽脅迫均對(duì)ZmPP2C基因的表達(dá)影響不明顯,且表達(dá)水平隨著脅迫時(shí)間延長略微下降；而在逆境恢復(fù)階段,基因表達(dá)量又逐漸恢復(fù)到正常水平。 3.玉米ZmPP2C基因的亞細(xì)胞定位 構(gòu)建表達(dá)載體pBI121-ZmP

4、P2C-GFP,將ZmPP2C-GFP在洋蔥表皮細(xì)胞內(nèi)融合蛋白表達(dá)。在洋蔥表皮細(xì)胞的細(xì)胞核上觀察到綠色熒光,表明ZmPP2C定位于細(xì)胞核。而在對(duì)照細(xì)胞中的細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中都有表達(dá)。這與TMpred軟件對(duì)ZmPP2C跨膜結(jié)構(gòu)分析一致。 4.轉(zhuǎn)ZmPP2C基因擬南芥的鑒定 構(gòu)建表達(dá)載體pBI121-ZmPP2C,利用花絮浸染法轉(zhuǎn)化野生型擬南芥(Col-0)。通過半定量RT-PCR和Western blot方法,在轉(zhuǎn)錄

5、和蛋白質(zhì)表達(dá)水平上鑒定了5株高表達(dá)的T3代轉(zhuǎn)化植株(L1～L5)。 5.過量表達(dá)ZmPP2C基因抑制擬南芥在脅迫下的萌發(fā)率和根的伸長 將轉(zhuǎn)基因植株和野生型擬南芥播種在含有不同濃度的氯化鈉和甘露醇的MS培養(yǎng)基上進(jìn)行萌發(fā)試驗(yàn)。7天后,過量表達(dá)ZmPP2C基因的擬南芥相對(duì)于野生型其萌發(fā)率和根的伸長都受到抑制。而在對(duì)照狀態(tài)下其萌發(fā)率和根的伸長沒有明顯差別。 6.轉(zhuǎn)ZmPP2C基因擬南芥在逆境脅迫條件下的生理變化

6、為了檢測轉(zhuǎn)ZmPP2C基因擬南芥在脅迫條件下的變化,我們測定了一系列和植物逆境脅迫有密切關(guān)系的生理指標(biāo),包括凈光合速率,游離脯氨酸的積累,MDA含量,膜透性以及失水速率等。結(jié)果表明,未處理的轉(zhuǎn)基因和野生型擬南芥的這些指標(biāo)沒有明顯變化。但是脅迫處理后,不管是野生型還是轉(zhuǎn)基因植株凈光合速率都下降,但野生型擬南芥下降的更明顯；轉(zhuǎn)基因擬南芥中Pro積累的量遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于野生型；而轉(zhuǎn)基因植株中MDA含量和失水速率均高于野生型。這些結(jié)果表明,過量表達(dá)Zm

7、PP2C基因降低了轉(zhuǎn)基因擬南芥對(duì)逆境脅迫的抗性。 7.逆境脅迫相關(guān)基因的RT-PCR分析 為了檢測鹽脅迫和干旱脅迫下轉(zhuǎn)基因和野生型擬南芥脅迫相關(guān)基因的表達(dá)情況,選取脅迫相關(guān)基因RD29A,RD29B,P5CS1,P5C82,ABI1和ABI2用于研究。結(jié)果表明,相對(duì)于野生型擬南芥,在高鹽或干旱脅迫12到24小時(shí)內(nèi),轉(zhuǎn)基因擬南芥中RD29A,RD29B,PSCS1,P5CS2表達(dá)量降低或較慢。在高鹽脅迫條件下,ABI1和A

8、BI2的表達(dá)量明顯降低。在干旱脅迫下,ABI1的表達(dá)量基本不變,而ABI2表達(dá)量明顯降低。 8.轉(zhuǎn)基因擬南芥植株降低了對(duì)ABA的敏感性 在對(duì)照培養(yǎng)基上,轉(zhuǎn)基因擬南芥和野生型擬南芥發(fā)芽率沒有明顯差別,幾乎都是100％萌發(fā),而在含有ABA的培養(yǎng)基上,轉(zhuǎn)基因擬南芥的萌發(fā)率明顯高于野生型,即轉(zhuǎn)基因擬南芥對(duì)ABA的敏感性降低,根的伸長也是如此。 9.過量表達(dá)ZmPP2C基因降低了轉(zhuǎn)基因玉米的抗旱性 構(gòu)建表達(dá)載體pC