棉花蛋白磷酸酶2C60基因(GhPP2C60)的鑒定及生物學(xué)功能分析.pdf

1、蛋白質(zhì)的可逆磷酸化過程是蛋白磷酸酶與蛋白激酶共同合作完成的，通過修飾底物分子實現(xiàn)信號傳遞，從而對生物體的生長發(fā)育及生理生化過程進(jìn)行調(diào)控。大量研究表明，蛋白激酶廣泛參與到植物逆境脅迫過程并起到正調(diào)控的作用，蛋白磷酸酶與蛋白激酶一樣，在植物生理代謝中起到重要作用，但研究相對較少。PP2C是一類絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酶，在植物中參與逆境脅迫觸發(fā)的信號傳導(dǎo)途徑，同時與細(xì)胞生長發(fā)育、生長周期的調(diào)節(jié)等過程也有一定相關(guān)性。目前對于 PP2C家族的報道

2、，大多局限于研究 A、B亞族在ABA信號途徑中發(fā)揮的作用，而對其他亞族中的成員則研究較少。我國是棉花生產(chǎn)大國，在實際生產(chǎn)中，不利的氣候條件和病菌的感染會對棉花產(chǎn)量和質(zhì)量造成嚴(yán)重影響。因此，利用分子生物學(xué)手段研究棉花抗逆機(jī)制，能夠為育種工作奠定堅實的理論基礎(chǔ)。在棉花中研究PP2C基因的抗逆功能，可以使棉花更好的適應(yīng)逆境脅迫，創(chuàng)造更高的經(jīng)濟(jì)價值。本研究中，我們從棉花中克隆得到一個PP2C基因GhPP2C60，并對其不同脅迫下的表達(dá)模式和生物

3、學(xué)功能進(jìn)行了研究，結(jié)果如下：
　?。?）GhPP2C60 cDNA的開放閱讀框（ORF）1086bp，推導(dǎo)出一個含362個氨基酸的蛋白序列，DANman預(yù)測其分子量及pI值分別為39.8KDa和4.68。氨基酸序列比對結(jié)果發(fā)現(xiàn)，GhPP2C60基因在進(jìn)化過程中保守，并且擁有PP2C家族中11個典型的保守催化結(jié)構(gòu)域。聚類分析表明GhPP2C60歸屬于PP2C家族中I亞族。
　　（2）亞細(xì)胞定位實驗發(fā)現(xiàn)GhPP2C60定位于細(xì)胞

4、質(zhì)中，說明GhPP2C60在細(xì)胞質(zhì)中發(fā)揮作用。
　?。?）對GhPP2C60在轉(zhuǎn)錄水平與蛋白水平上的表達(dá)特性進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)低溫、高溫及Pst DC3000病原細(xì)菌可以誘導(dǎo)GhPP2C60的表達(dá)，脫落酸（abscisic acid, ABA）及茉莉酸甲酯（methyl jasmonate, MeJA）植物激素可以不同程度地抑制該基因的表達(dá)，同時受SA激素處理影響較小，表明GhPP2C60參與多種信號分子介導(dǎo)的抗逆信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，在植物

5、抵御外界脅迫的防衛(wèi)反應(yīng)中發(fā)揮作用。
　?。?）利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤法轉(zhuǎn)化本生煙，獲得GhPP2C60超表達(dá)煙草植株。繼而進(jìn)行在ABA處理條件下的種子萌發(fā)實驗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)GhPP2C60可能參與ABA介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，促進(jìn)種子的休眠，增強(qiáng)了種子萌發(fā)期對ABA的敏感程度，且影響了氣孔的開閉程度。
　?。?）將GhPP2C60超表達(dá)煙草植株進(jìn)行高溫及Pst DC3000病原菌脅迫處理，發(fā)現(xiàn)超表達(dá)GhPP2C60明顯增強(qiáng)了植株對高溫

6、和病原菌脅迫的敏感性，改變了防衛(wèi)反應(yīng)相關(guān)基因在處理前后的表達(dá)量。進(jìn)一步實驗證明，超表達(dá)葉片在處理后積累了更多的活性氧物質(zhì)，其體內(nèi)抗氧化酶相關(guān)基因的表達(dá)量、抗氧化物酶活較野生型有所下降，意味著GhPP2C60參與調(diào)節(jié)體內(nèi)ROS的變化。同時，GhPP2C60沉默棉花植株則對高溫及Pst DC3000病原細(xì)菌脅迫表現(xiàn)為抗性，說明該基因作為負(fù)調(diào)控因子，參與到植物應(yīng)對高溫及Pst DC3000脅迫的過程。
　?。?）Pst DC3000病原