玉米脫落酸受體(PYL3)與2C型絲氨-蘇氨酸蛋白磷酸酶(PP2C)的互作分析.pdf

1、脫落酸(abscisic acid，ABA)是五大類(lèi)植物激素之一，參與調(diào)控植物各階段的生長(zhǎng)發(fā)育，如種子萌發(fā)、成熟與休眠、根系發(fā)育、葉片枯萎等。作為“逆境激素”，在植物應(yīng)對(duì)干旱、寒冷和高鹽等各種環(huán)境脅迫過(guò)程中也發(fā)揮著關(guān)鍵作用。ABA的生理功能從上個(gè)世紀(jì)六十年代以來(lái)已經(jīng)逐步得到了闡明，而對(duì)ABA介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑卻知之甚少。特別是細(xì)胞的ABA受體和其下游成分，一直爭(zhēng)論不休。2009年，《Science》雜志同期發(fā)表了兩個(gè)研究組在擬南芥上的獨(dú)

2、立研究成果。他們通過(guò)結(jié)構(gòu)生物學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，并經(jīng)酵母雙雜交和免疫共沉淀等實(shí)驗(yàn)證明，PYL(pyrabactin resistance1-like)蛋白是ABA的受體，PYL與ABA結(jié)合后發(fā)生構(gòu)型變化，阻礙底物蛋白進(jìn)入PP2C的催化活性中心，直接抑制PP2C的磷酸酶活性，證明PP2C可能是ABA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的第二信使。
　　但是，在擬南芥上的研究表明，PYL家族有14個(gè)成員，PP2C家族更分為13個(gè)亞家族，成員多達(dá)80個(gè)。所有這些成員之

3、間并不都存在互作關(guān)系，也不一定都參與ABA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。本研究的前期生物信息學(xué)分析表明，玉米基因組的PYL序列分為3個(gè)亞家族共13個(gè)成員，PP2C序列分為16個(gè)亞家族，成員多達(dá)130個(gè)。本研究對(duì)玉米ZmPYL3和ZmPP2C16蛋白進(jìn)行了生物信息學(xué)預(yù)測(cè)和分析，利用酵母雙雜交和雙分子熒光互補(bǔ)技術(shù)檢測(cè)ZmPYL3與ZmPP2C16蛋白的互作情況，并用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)ABA誘導(dǎo)下ZmPYL3和ZmPP2C16基因的表達(dá)情況，以期為玉米ABA

4、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑研究提供參考。
　　主要研究結(jié)果如下:
　　(1)對(duì)氨基酸組成、跨膜結(jié)構(gòu)域和亞細(xì)胞定位、二級(jí)以及三級(jí)結(jié)構(gòu)的生物信息學(xué)預(yù)測(cè)表明，ZmPYL3和ZmPP2C16是親水的酸性蛋白，分布于細(xì)胞質(zhì)中，主要結(jié)構(gòu)元件為α螺旋和無(wú)規(guī)則卷曲。進(jìn)化樹(shù)分析表明，ZmPYL3與擬南芥PYL三亞家族各成員的親緣關(guān)系較近，而ZmPP2C16與擬南芥PP2C響應(yīng)ABA誘導(dǎo)的6個(gè)A類(lèi)成員親緣關(guān)系較近。
　　(2)用ZmPYL3和ZmPP2

5、C16基因分別構(gòu)建酵母雙雜交誘餌載體pGADT7-ZmPYL3和捕獲載體pGBKT7-ZmPP2C16，共轉(zhuǎn)化酵母AH109菌株，以pGADT7-T和pGBKT7-53共轉(zhuǎn)化體作陽(yáng)性對(duì)照,pGADT7-T和pGBKT7-Lam共轉(zhuǎn)化體作陰性對(duì)照，在營(yíng)養(yǎng)缺陷型培養(yǎng)基SD/-Trp-Leu-His-Ade上篩選，再經(jīng)過(guò)ABA誘導(dǎo)后，用5-溴-4-氯-3-吲哚基β-D-吡喃半乳糖苷顯色。結(jié)果表明，pGADT7-ZmPYL3和pGBKT7-Zm

6、PP2C16的共轉(zhuǎn)化體，與陽(yáng)性對(duì)照一樣正常生長(zhǎng)，在ABA誘導(dǎo)下顯現(xiàn)藍(lán)色，而陰性對(duì)照不顯色，表明ZmPYL2和ZmPP2C16存在相互作用關(guān)系。
　　(3)分別將ZmPYL3和ZmPP2C16基因插入pSY736和pSY735質(zhì)粒，構(gòu)建雙分子熒光互補(bǔ)載體pSY736-ZmPYL3(YFPN)和pSY735-ZmPP2C16(YFPC)，共轉(zhuǎn)化玉米原生質(zhì)體。熒光共聚集顯微鏡檢測(cè)結(jié)果表明ZmPYL3和ZmPP2C16蛋白之間存在著互作，

7、而且互作發(fā)生在細(xì)胞質(zhì)中。
　　(4)以玉米自交系“B73”為材料，用實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析ZmPYL3和ZmPP2C16基因在ABA誘導(dǎo)下的表達(dá)模式。結(jié)果表明:ZmPYL3基因在ABA誘導(dǎo)下下調(diào)表達(dá);ZmPP2C16基因在ABA誘導(dǎo)下上調(diào)表達(dá)。
　　綜上所述，ZmPYL3和ZmPP2C16可在ABA誘導(dǎo)下相互作用，其編碼基因響應(yīng)ABA誘導(dǎo)而下調(diào)或上調(diào)表達(dá)，說(shuō)明ZmPYL3和ZmPP2C16分別是玉米的ABA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的受體