鳶尾蛋白磷酸酶2C(PP2C)基因的克隆和功能分析及擬南芥PP2C基因家族的鑒定和基因組學(xué)分析.pdf

1、蛋白磷酸酶和蛋白激酶分別參與蛋白質(zhì)的磷酸化和去磷酸化過(guò)程，在植物信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中起重要的調(diào)節(jié)作用。蛋白磷酸酯酶2C(PP2C)是蛋白磷酸酶中的一大類(lèi)，與植物的生長(zhǎng)發(fā)育、細(xì)胞周期調(diào)節(jié)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及環(huán)境脅迫應(yīng)答等各種生物學(xué)過(guò)程相關(guān)。迄今為止，對(duì)植物PP2C的研究只是局限于個(gè)別基因的鑒定與功能分析，沒(méi)有從基因組水平對(duì)此基因家族進(jìn)行大規(guī)模的鑒定和基因組學(xué)分析。 擬南芥基因組測(cè)序的完成為全面分析其基因家族提供了條件。實(shí)驗(yàn)中利用已知的PP2C基

2、因序列作為檢索條件，通過(guò)BLAST查找其同源基因，從模式植物擬南芥基因組中獲得了編碼PP2C蛋白的基因序列。對(duì)上面的結(jié)果經(jīng)過(guò)數(shù)據(jù)處理之后，再用SMART和Pfam檢測(cè)序列中的PP2C元件，最后從擬南芥基因組中鑒定到了80個(gè)PP2C基因。在此基礎(chǔ)之上，我們又對(duì)擬南芥PP2C家族做了大規(guī)模的基因組學(xué)分析。 同時(shí)，我們從鳶尾(Iris tectorum)中克隆到了一個(gè)PP2C基因，命名為IrisPP2C1(Iris tectorum

3、Protein Phosphatase 2C1)。實(shí)驗(yàn)中采用在洋蔥表皮細(xì)胞中瞬時(shí)表達(dá)的方法對(duì)IrisPP2C1蛋白的亞細(xì)胞定位進(jìn)行了研究；然后又通過(guò)在擬南芥中過(guò)表達(dá)IrisPP2C1的方法對(duì)該基因的功能進(jìn)行了初步研究。主要研究結(jié)果如下： 1)依據(jù)植物蛋白磷酸酶2C(Protein Phosphatase 2C，PP2C)基因的保守區(qū)設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物，運(yùn)用RT-PCR方法，從鳶尾花中分離出一個(gè)長(zhǎng)度為1198bp的PP2C基因的cDNA

4、克隆，編碼393個(gè)氨基酸，并命名為IrisPP2C1，Genbank注冊(cè)號(hào)為：EU366253。序列比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)IrisPP2C1具備PP2C基因的保守結(jié)構(gòu)域。 2)Southern雜交分析顯示，IrisPP2C1基因在鳶尾基因組中以低拷貝形式存在，并存在一個(gè)小的PP2C基因家族。Northern雜交分析表明，該基因的表達(dá)受植物激素ABA(Abscisic Acid)的誘導(dǎo)。 3)IrisPP2C1與GFP融合蛋白基因

5、在CaMV 35S啟動(dòng)子的驅(qū)動(dòng)下轉(zhuǎn)入洋蔥表皮細(xì)胞，在洋蔥表皮細(xì)胞的細(xì)胞核上檢測(cè)到綠色熒光，表明IrisPP2C1蛋白定位于細(xì)胞核上。這一結(jié)果與跨膜結(jié)構(gòu)分析和核定位分析結(jié)果相一致。 4)構(gòu)建表達(dá)載體pBI121-IrisPP2C1，利用農(nóng)桿菌浸染法將35S::IrisPP2C1轉(zhuǎn)入擬南芥。利用PCR的方法，對(duì)轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行了鑒定。轉(zhuǎn)基因呈現(xiàn)植株矮小，葉片變小、形狀變圓、顏色變深綠等表型。 5)在含有植物激素ABA的培養(yǎng)基萌

6、發(fā)時(shí)，轉(zhuǎn)基因擬南芥種子的萌發(fā)率低于野生型擬南芥；在含有5μM和10μM ABA的培養(yǎng)基上，野生型和轉(zhuǎn)基因植株根的伸長(zhǎng)受到了不同程度的抑制，但轉(zhuǎn)基因植株的受抑制程度遠(yuǎn)大于野生型植株。結(jié)果表明，過(guò)量表達(dá)IrisPP2C1基因提高了轉(zhuǎn)基因擬南芥對(duì)ABA的敏感性，也就是說(shuō)IrisPP2C1在ABA信號(hào)調(diào)控過(guò)程中起到正調(diào)控作用。 6)利用BLAST同源檢索工具，從擬南芥全基因組序列中鑒定到了80個(gè)PP2C基因。 7)利用neigh

7、bor-joining法構(gòu)建擬南芥中PP2C基因家族的系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)，根據(jù)分支上的解靴帶值(bootstrap value)將擬南芥PP2C家族分為13個(gè)亞家族，基因結(jié)構(gòu)和蛋白質(zhì)元件分析結(jié)果都支持這一分類(lèi)。進(jìn)一步分析表明PP2C各個(gè)亞家族在雙子葉植物分化之前就已經(jīng)形成。 8)利用MEME元件分析工具獲得了PP2C基因家族中20個(gè)保守元件(motif)序列，這些元件中大部分廣泛分布于PP2C基因家族成員中，而個(gè)別元件僅僅存在于少數(shù)幾個(gè)